基于微小RNA-142-3p 與細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4 的 相互作用探討細胞因子在原因不明反復性流產的作用

劉細紅，李 麗，譚素萍，張金瑞，李輝珍，李 琪

[中國科學院大學深圳醫院（光明）婦科，廣東 深圳 518107]

原因不明反復性流產（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA）是指女性與同一性伴侶連續兩次及以上發生自然流產，且與染色體、解剖結構、內分泌、自身免疫異常和生殖道疾病等因素無關，是臨床上育齡女性常見的妊娠疾病之一[1]。目前在臨床上URSA 仍屬難治性不孕癥，給男女雙方造成極大的痛苦，已成為國內外專家共同關注的醫學難題。近期，生殖免疫學觀點認為，正常胚胎不被母體排斥有賴于母胎界面的免疫耐受，而一旦這種格局被打破將導致URSA 的發生[2]。研究發現，在體內抑制細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（CTLA-4）可以解除調節性T 細胞（Treg）介導的移植排斥反應的保護作用，表明CTLA-4 的表達可調節Treg 細胞的功能[3]。另外，微小RNA-142-3p（miR-142-3p）是一種長19～24 核苷酸的短鏈非編碼小RNA，調控樹突狀細胞及巨噬細胞功能，并與T 細胞異常激活、維持Treg 細胞穩態及免疫抑制功能有關[4]。因此，本研究通過結合臨床樣本，探究免疫功能失調與URSA 的發病機制相關性，并初步探討其發病的潛在機制，為臨床預防與治療提供理論參考依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2016 年9 月至2017 年12 月中國科學院大學深圳醫院（光明）收治的45 例URSA 患者納入流產組，另選取同期于中國科學院大學深圳醫院（光明）進行檢查的40 例健康早孕者作為對照組進行回顧性研究。流產組研究對象年齡24～36 歲，平均年齡（29.15±4.29）歲；身高158.39～170.21 cm，平均身高（166.14±5.24）cm；體質量45.83～70.51 kg，平均體質量（64.82±5.76）kg；身體質量指數（BMI）18～25 kg/m2，平均BMI（23.54±2.40）kg/m2；腰圍57.38～78.51 cm，平均腰圍（63.02±1.77）cm；臀圍84.27～108.73 cm，平均臀圍（92.43±4.24）cm；腰臀比0.55～0.73，平均腰臀比0.68±0.04。對照組研究對象年齡23～37 歲，平均年齡（28.28±4.75）歲；身高157.46～168.46 cm，平均身高（165.79±8.06）cm；體質量45.27～70.88 kg，平均體質量（62.9±6.61）kg；BMI 18～25 kg/m2，平均BMI（23.04±3.35）kg/m2；腰圍55.86～76.33 cm，平均腰圍（63.4±1.69）cm；臀圍82.75～105.41 cm，平均臀圍（92.74±4.37）cm；腰臀比0.57～0.76，平均腰臀比0.69±0.04。本研究經中國科學院大學深圳醫院（光明）醫學倫理委員會批準。流產組產婦納入標準：①符合《復發性流產診治的專家共識》[5]中原因不明反復性流產的診斷標準；②流產在妊娠3 個月內；③自然流產2 次以上；④患者雙方無遺傳性疾病；⑤內分泌正常、無代謝性疾病；⑥封閉抗體、血小板聚集等生化檢測正常；⑦無過敏史。排除標準：①有分泌系統疾病者；②有梅毒等病原微生物生殖道感染者；③臨床診斷資料缺失者；④患者出現明顯病情變化。對照組產婦納入標準：①未經任何臨床治療的自然妊娠孕婦；②封閉抗體、血小板聚集、血常規、肝功能等生化檢測正常。排除標準：①合并臟器疾病、生殖道感染、生殖道畸形者；②臨床診斷資料缺失者；③研究對象出現明顯病情變化。

1.2 檢測方法

1.2.1 一般臨床指標檢測 在流產組治療期間及對照組產檢期間，通過詢問、測量等手段，對人口學相關資料進行記錄登記。

1.2.2 流式細胞術檢測外周血CD4+CD25+Treg 細胞 分別采集研究對象清晨空腹靜脈血于肝素抗凝管中，加入紅細胞裂解液離心、PBS 緩沖液洗滌；嚴格按照說明書操作，對照管加入FITC 標記山羊抗兔IgG（FITC-IgG）和PE 標記小鼠抗山羊IgG（PE-IgG）；實驗管加入FITC 標記小鼠抗人CD4（CD4-FITC）和PE 標記小鼠抗人CD25（CD25-PE）（美國R&D 公司），室溫避光孵育后，離心（3 500 r/min 轉速，時間10 min），取上清液；加入細胞染色緩沖液，采用流式細胞儀（美國BD 公司，型號：BD Accuri C6）檢測。

1.2.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測Th1/Th2 型細胞因子 抽取研究對象外周靜脈血，離心取上清液。檢測γ 干擾素（IFN-γ）、白細胞介素-2（IL-2）、白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-10（IL-10）水平，按照ELISA 試劑盒說明書進行操作。使用多功能酶標儀（美國Bio-Tek 公司，型號：Synergy H1）測定各孔的吸光值，進一步推斷計算各個標本中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10 的濃度。

1.2.4 熒光素酶檢測 培養293T 細胞，取質粒2 μg，野生型（Wild type，WT）/突變型（Mutant type，Mut）psi CHECK2報告載體：miR-142-3p 擬似物（miR-142-3p minic）/miR-142-3p 抑制劑（miR-142-3p inhibitor）=1∶1，與0.5 mL 減血清培養基（opti-MEM）混勻；取5 μL 脂質體200 轉染試劑與0.5 mL opti-MEM 混勻；將質粒混合物與轉染試劑混合物混勻，靜置。將上述混合物均勻滴加到標記好的六孔板中，恒溫培養。將培養基吸除，加裂解緩沖液裂解細胞，移入96 孔板；加熒光素酶測定試劑Ⅱ檢測熒光值。BLAST 生信分析，在Targetscan 官方網站上（https://www.targetscan.org/vert_80/）基因名稱輸入CTLA-4，microRNA 名稱內輸入miR-142-3p，點擊提交。檢索到603 個保守位點的轉錄本，搜索到對應CTLA-4 對應的信息，找到miR-142-3p 與CTLA-4 潛在結合的信息。

1.3 觀察指標①分析兩組研究對象外周血中CD4+CD25+Treg 細胞百分比。②分析兩組研究對象外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 細胞因子水平。③分析miR-142-3p 與CTLA-4 的相互作用。④通過BLAST 生信分析檢索結果，找到CTLA-4 轉錄本，明確miR-142-3p與CTLA-4 結合具體信息。

1.4 統計學分析采用SPSS 20.0 統計學軟件處理數據。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t法或S-N-K 法。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 比較兩組研究對象外周血中CD4+CD25+Treg 細胞百分比流產組研究對象外周血中CD4+CD25+Treg 細胞百分比[（4.06±1.53）%]顯著低于對照組[（7.95±1.13）%]，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1、圖2、圖3。

圖1 對照組研究對象CD4+CD25+Treg 細胞流式細胞儀檢測圖

圖2 流產組研究對象CD4+CD25+Treg 細胞流式細胞儀檢測圖

圖3 兩組研究對象CD4+CD25+Treg 細胞百分比比較

2.2 兩組研究對象外周血中IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 水平比較流產組研究對象外周血中IL-10 和IL-4 的表達水平低于對照組，而IL-2 和IFN-γ 的表達水平高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）；同時，流產組研究對象的IL-2/IL-10、IFN-γ/IL-4 比值分別為（0.96±0.19）和（0.89±0.21），高于對照組（0.43±0.18、0.41±0.15），差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1 兩組研究對象外周血IFN-γ、IL-2、IL-4 及IL-10 水平比較（pg/mL，x）

2.3 miR-142-3 與CTLA-4 相互作用檢測通過BLAST生信分析，明確miR-142-3p 與CTLA-4 潛在的結合位點，發現兩者有較好的結合能力。同時，進一步通過熒光素酶報告基因檢測，結果顯示miR-142-3p 與CTLA-4 有較強的結合能力，表明miR-142-3p 對CTLA-4 的表達具有潛在的抑制作用，見圖4。

圖4 miR-142-3p 與CTLA-4 結合位點和結合能力分析

3 討論

近年來，隨著機體免疫學研究的不斷深入，發現URSA與異常的母體系統免疫反應有關，其具體的發病機制尚待進一步研究[6-7]。有研究顯示，與正常未孕婦女及URSA 患者相比，正常早孕婦女外周血CD4+CD25+Treg 細胞水平顯著升高，表明CD4+CD25+Treg 細胞在維持正常妊娠中扮演重要角色，可能對母胎免疫耐受具有調節作用[8]。研究表明，CD4+CD25+Treg 細胞在細胞免疫功能中發揮極其重要的作用[9]。在器官移植的免疫排斥反應中，CD4+CD25+Treg細胞數量減少，CD4+CD25+T 細胞被激活產生細胞毒性，引起免疫損傷，并協助B 細胞參與抗原-抗體聯合反應。在T 細胞受體激活后，Tregs 可抑制CD4+和CD8+T 淋巴細胞細胞中IL-2 基因的轉錄和表達，以抑制T 細胞的增殖和激活，從而調節免疫耐受[10]。本研究發現，流產組研究對象外周血CD4+CD25+Treg 細胞顯著高于對照組，與上述研究結果類似。另外，與正常妊娠組相比，URSA 患者體內Th1 型細胞因子呈遞增趨勢，而Th2 型細胞因子呈下降趨勢，從而導致流產發生，故調節Th1/Th2 的平衡有助于降低URSA 的發生率[11]。本研究結果顯示，URSA 患者的外周血細胞因子IL-10 和IL-4 的表達水平均顯著低于對照組，而細胞因子IL-2 和IFN-γ 的表達水平高于對照組。

CTLA-4 已被證明是T 細胞功能的負調控因子，參與Th1/Th2 細胞的發育和Treg 細胞的功能，在維持免疫系統內穩態方面的關鍵作用[12]。研究顯示，抗CTLA-4 抗體可增強Th1 型免疫和抑制Treg 細胞活性[13]。同時，許多微小RNA（miRNA）在多種病理病例中直接或間接調節CTLA-4和程序性死亡受體-1/程序性死亡配體-1（PD-1/PD-L1）的表達[14]。

綜上所述，miR-142-3p 與CTLA-4 具有較強的結合能力，表明miR-142-3p 對CTLA-4P 的表達具有潛在的抑制作用，這可能是導致URSA 發生的可能機制之一。