華南地區380株結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變情況分析

鄧麗 王楠 雷杰 牛群 吳玲 龔蘭 謝貝 王琪 李華 楊瑜 劉志輝 孟繁榮

廣州市胸科醫院肺部疾病研究所 呼吸疾病國家重點實驗室，廣州 510095

結核病為一種侵擾人類至少有7 000 年歷史的古老疾病，但目前仍為單因致死率最高的傳染性疾病，是全球的重大公共衛生問題［1］。結核分枝桿菌耐藥性的出現與蔓延，更使人類結核病控制形勢雪上加霜，如何提高耐藥尤其是耐多藥結核病患者的治療水平，又如何有效阻斷其傳播，是世界衛生組織（WHO）實現2035 年全球終止結核病目標的棘手難題［2］。明晰其耐藥機制，并由此研發抗結核新藥與診斷新技術則為解決問題的基礎與關鍵。目前，臨床應用的抗結核藥物共33 種，其中異煙肼為全殺菌一線抗結核藥物［3］；一旦結核分枝桿菌同時對異煙肼與另一種全殺菌一線抗結核藥物利福平耐藥，則被介定為低治愈率、高病死率的耐多藥結核病［4］。因此，結核分枝桿菌異煙肼耐藥倍受人們重視，對其耐藥機制的研究也取得了豐碩的成果，目前人們認為結核分枝桿菌過氧化氫-過氧化物酶編碼基因katG 和烯酰-酰基載體蛋白還原酶編碼基因inhA 基因突變為主要機制，編碼烷羥基丙二酸還原酶的ahpC 啟動子區（oxyR-ahpC）、編碼β-酮酰基載體蛋白合成酶的kasA 基因和編碼NADH 脫氫酶的ndh 基因突變也參與其中，但這些基因突變發生頻度與其耐藥表型的關聯性則報道不一［5］。為豐富相關循證醫學證據，我們對華南地區236 株異煙肼耐藥結核分枝桿菌株和144 株異煙肼敏感結核分枝桿菌株的katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因突變情況進行了分析，現報道如下。

資料與方法

1.一般資料

1.1.菌株來源 在廣州市胸科醫院結核病生物樣本庫中選擇異煙肼耐藥結核分枝桿菌株236 株、異煙肼敏感結核分枝桿菌株144株。

1.2.試劑與儀器 結核分枝桿菌DNA 提取試劑盒、溶菌酶為上海生物工程公司產品，分枝桿菌Middlebrook 7H10 培養基為美國BD 公司產品，C1000TM Thermal Cycler PCR 擴增儀、DNA 水平電泳儀、Gel DocTM XR+ImagineSystem 凝膠成像儀由美國BIO-RAD 公司生產，Nano Drop one 超微量紫外分光光度計由美國Thermo fisher公司生產。

2.實驗方法

2.1.PCR 擴增引物 參考結核分枝桿菌H37Rv 標準株katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因序列，設計5 種基因PCR 擴增引物（表1），引物合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

表1 5種基因PCR擴增引物設計

2.2.結核分枝桿菌復蘇培養 在生物樣本庫中選擇目的結核分枝桿菌株，應用Middlebrook 7H10 培養基進行復蘇培養，收獲對數生長期純培養物。

2.3.DNA 提取 85 ℃ 45 min 滅活上述檢測株純培養物，按結核分枝桿菌DNA 提取試劑盒說明書進行DNA 提取，并應用Nano Drop one 超微量紫外分光光度計檢測DNA提取純度，符合要求者行PCR擴增。

2.4.PCR 擴增 反應總體積為50 μl：TaKaRa Taq（5 U/μl）0.5 μl、10×PCR Buffer 5 μl、dNTP Mixture 4 μl、DNA模板1 μl、上下游引物各2 μl、滅菌蒸餾水35.5 μl。反應條件：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，50～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s～1 min，循環30 次；最后72 ℃延伸7 min。PCR 擴增完成后，取PCR 擴增產物4 μl 在1%瓊脂糖凝膠上電泳，應用Gel DocTM XR+ImagineSystem 凝膠成像儀觀察結果，檢測PCR產物是否合格，合格者進入基因測序環節。

2.5.基因序列測定與分析 基因測序由北京六合華大基因科技有限公司完成，以結核分枝桿菌H37Rv 標準序列為參照，應用DNAMAN、CHORMAS、DNASTAR 等軟件分析基因突變結果。

3.統計學方法

應用Microsoft Office Excel 2013 收集相關資料，以katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA、ndh 基因分類和單基因突變、雙及多基因突變分別進行行分類，描述性分析各基因突變出現的頻率。

結 果

1.5 種結核分枝桿菌異煙肼耐藥相關基因突變的總體情況分析（表2）

表2 380株結核分枝桿菌臨床分離株異煙肼（INH）耐藥的5種基因突變總體情況

在INH 耐藥株中發現26 個位點29 種突變類型，在INH敏感株中發現16 個位點17 種突變類型。在katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 中分別發現3 個位點5 種突變、5 個位點5 種突變、11 個位點13 種突變、6 個位點6 種突變和11 個位點11 種突變。基因突變類型以katG 基因315AGC（S）→ACC（T）、mabA-inhA 基因-15T→C 最為常見。

2.結核分枝桿菌基因突變模式分析（表3）

表3 380株結核分枝桿菌臨床分離株的INH耐藥基因突變類型

在異煙肼耐藥結核分枝桿菌菌株中發現20種單基因突變模式株、18種雙基因突變模式株，在異煙肼敏感結核分枝桿菌菌株中則見到12種單基因突變模式、1種雙基因突變模式、1種3基因突變模式和1種4基因突變模式，也發現3株結核分枝桿菌在同一基因上的兩個不同位點存在突變，但雙基因以上突變模式發生的頻率很小，僅為7.89%（30/380）。

討 論

在抗結核治療中，異煙肼為最有效的早期殺菌活性藥物，其進入結核分枝桿菌后由菌體過氧化物-過氧化氫酶將其轉化為活性形式，它可與脂酰基載體蛋白M（AcpM）及β-酮脂酰載體蛋白合成酶（KasA）通過共價鍵形成復合體，抑制結核分枝桿菌分枝菌酸的合成而破壞細菌細胞壁；而katG 基因突變或缺失、inhA 基因或ahpC 啟動子突變導致的基因過表達是結核分枝桿菌對異煙肼產生耐藥的主要分子機制［6-7］。不過到目前為止，這些基因突變仍不能全面闡釋結核分枝桿菌的異煙肼耐藥，更多可能的異煙肼耐藥的相關基因將會被不斷發現。有研究報道，應用結核分枝桿菌全基因組測序可將異煙肼耐藥預測的靈敏度和特異度分別達到97.1%和99.0%［8］。這為我們探尋結核分枝桿菌異煙肼耐藥新機制提供了更為有用的分子生物學信息。我們的研究顯示：katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 5 個基因的36 個位點呈現出40 種基因突變類型、28 種單基因和21 種雙基因以上突變模式（表2、表3），異煙肼耐藥株katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC 基因突變的頻率分別為52.11%、22.46%和5.93%。Krittanan 等［9］在泰國結核分枝桿菌異煙肼耐藥株中發現33 種突變，katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC基因突變的頻率分別為84.8%、9.1%和6.1%；來自蒙古的文獻［10］報道katG、mabA-inhA 基因突變的頻率分別為28.11%和72.37%；而吉爾吉斯共和國的研究［11］則顯示katG、mabA-inhA 和oxyR-ahpC 基因突變的頻率分別為91.2%、7%和1.8%，這些研究結果充分顯示結核分枝桿菌異煙肼耐藥的相關基因突變具有明顯的地域性特點。同時還有研究顯示，結核分枝桿菌異煙肼耐藥基因突變的地域性分子特征也會隨時間的推移發生一定的變化，Huo 等［12］報道我國異煙肼耐藥結核分枝桿菌katG 基因突變率已由2005 年的76.8%降至2015年的70.5%，mabA-inhA 基因突變率則相應由14.6%升至26.7%，這預示結核分枝桿菌異煙肼耐藥的分子機制也具有一定的時序性，如何科學把握結核分枝桿菌異煙肼耐藥的時空特征并應用于耐藥結核病控制實踐，是擺在人們面前的一大課題。

從表2、表3我們還可看到，在144株異煙肼敏感結核分枝桿菌株中，在34 株（23.61%）中檢測到基因突變，katG、mabA-inhA、oxyR-ahpC、kasA 和ndh 基因突變的發生率分別為11.11%、11.11%、4.17%、1.39%和3.47%，如何解釋在異煙肼敏感結核分枝桿菌株中竟然有如此高比例的基因突變發生，的確不是一個簡單的科學問題。我們認為原因不外以下幾個方面：一是耐藥表型檢測問題，二是耐藥異質性問題，三是基因突變的實質性意義問題，四是其他藥物耐藥的影響問題。耐藥表型問題可以通過藥物敏感性測試復核予以糾正，耐藥異質性問題目前已有文獻報道確實存在［13］，也的確有的基因突變為無義突變，如本文表2 的katG 基因295CAG（Q）→CAA（Q），通過仔細的分析發現，結核分枝桿菌其他抗結核藥物耐藥將對異煙肼耐藥相關的基因突變產生重要影響，我們認為需要引起密切關注，也將另文發表相關研究以拋磚引玉。

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