天麻洋參含片中天麻素和人參總皂苷的含量測定

◎楊 芳，龍澤霞，盧文艷，劉 穎，朱軍君

（1.常德市食品檢驗所，湖南 常德 415000；2.湖南德海制藥有限公司，湖南 常德 415000）

天麻洋參含片是一種保健食品，主要成分為天麻、西洋參等，經粉碎、滅菌、混合、制粒、干燥、壓片等工序制成片劑。按《保健食品檢驗與評價技術規范》開展功能學評價表明，天麻洋參含片具有明顯的延緩衰老功能[1-2]。目前保健食品相關的技術規范尚未制定天麻素及人參總皂苷含量測定方法，為提高產品的質量控制水平，確保產品質量的一致性。本文參照中國藥典及其他文獻[3-6]的方法測定，對天麻洋參含片的主要活性成分天麻素及人參總皂苷進行研究，分別建立了高效液相色譜法測定天麻洋參含片中天麻素含量和紫外-可見分光光度法天麻洋參含片中人參總皂苷含量。

1 實驗材料與儀器

1.1 材料

1.1.1 試樣

天麻洋參含片（批號：20200909、20200915、20201022）、陰性試樣（包括不含天麻陰性試樣、不含西洋參陰性試樣）均由湖南德海制藥有限公司生產。

1.1.2 標準品

天麻素（中國食品藥品檢定研究院，批號：110807-202010，含量：95.5%）；人參皂苷Re（中國食品藥品檢定研究院，批號：110754-201826，含量：97.4%）。

1.1.3 試劑

水為一級水；乙腈：色譜純，除非另有說明，本方法使用試劑均為分析純（如:無水乙醇、氯仿、磷酸、高氯酸、香草醛、冰乙酸、乙醇等）。

1.2 儀器

高效液相色譜儀配DAD 檢測器（安捷倫，1260型）、色譜柱（ULtimate AQ-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）、雙光束紫外-可見分光光度計（北京普析，UV-1900）、分析天平（精度為0.000 1 g）、KQ2200E型超聲波發生器、超純水儀、渦旋振蕩器。

2 方法與結果

2.1 天麻素的含量測定

2.1.1 實驗溶液的制備方法

（1）標準溶液的制備。精密稱定天麻素10.0mg（精度0.000 1 g），于50 mL 容量瓶中，加流動相溶解稀釋至刻度，混勻，即得0.191 mg/mL天麻素標準溶液[6-7]。

（2）試樣溶液的制備。取本品20 片，于研缽中研成細粉，精密稱定細粉1.0 g（精度0.000 1 g）試樣置于具塞錐形瓶中，加甲醇15 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min[8]，將甲醇液轉移至30 mL容量瓶中，于殘渣中加甲醇15 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min[8]，將甲醇液轉移至30 mL 容量瓶中，并用甲醇定容至刻度，混勻，過濾，取上清液5 mL，蒸干，加流動相溶解并轉移至10 mL 容量瓶中，并用流動相定容至刻度，混勻，即得試樣溶液，取適量上清液過0.22 μm 濾膜，待液相色譜測定。

（3）不含天麻陰性試樣溶液的制備。取天麻陰性試樣，按步驟（2）試樣溶液配制方法制成不含天麻陰性試樣溶液。

2.1.2 儀器參考條件

色譜柱：C18柱；以甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.1 moL/L 的磷酸二氫鉀溶液和0.1 moL/L 的磷酸二氫鈉溶液等量混合）一水（3.0：4.5：92.5）為流動相；流速為1.0 mL/min；檢測波長為220 nm；柱溫為35 ℃；進樣量是10 μL。

（1）檢測波長確定。取天麻素標準溶液，在DAD檢測器下掃描，結果天麻素標準溶液在219.61 nm 處有最大吸收[10]，故將220 nm 定位本品的檢測波長，具體如圖1 所示。

圖1 DAD 檢測器波長掃描圖

（2）流動相確定。分別選用了乙腈與0.05%磷酸，甲醇與0.05%磷酸等不同比例的流動相試驗，但均不能達到滿意效果，采用甲醇-磷酸鹽緩沖液（0.1 moL/L 的磷酸二氫鉀溶液和0.1 moL/L 的磷酸二氫鈉溶液等量混合）一水（3.0 ∶4.5 ∶92.5）為流動相后，天麻素與相鄰色譜峰分離度符合要求，陰性無干擾。色譜圖如圖2～圖4 所示。

圖2 標準溶液的色譜圖

圖3 試樣溶液的色譜圖

圖4 不含天麻素的陰性試樣溶液色譜圖

2.1.3 方法驗證

（1）提取條件的考察實驗。取本品20 片，于研缽中研成細粉，精密稱取細粉1.0 g（精確至0.000 1 g），于具塞錐形瓶中，考察不同體積的甲醇用量（15 mL、20 mL、30 mL、40 mL）、超聲時間（20 min、30 min、40 min、50 min、60 min）等，以考察提取效率，結果：加甲醇15 mL[9]，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min 后再重復1 次，試樣溶液色譜圖中天麻素峰面積穩定，故選擇甲醇15 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min，靜置30 min[8]將甲醇液轉移至30 mL 容量瓶中，于殘渣中加甲醇15 mL，渦旋混勻，超聲處理30 min。

（2）線性范圍考察。液相色譜法的自動進樣器精密吸取2.1.1 項中標準溶液1 μL、5 μL、10 μL、20 μL、30 μL、40 μL、50 μL 注 入 高效液相色譜儀，按2.1.2 節儀器參考條件測定。根據標準溶液的峰面積與進樣量，計算線性回歸方程。結果：線性回歸方程為Y=655 428X-651 265，R2=0.999 7，天麻素在0.191～5.73μg 的質量濃度范圍內的線性關系良好。

（3）精密度實驗考察。取2.1.1 節標準溶液10μL，注入高效液相色譜儀，按2.3.1 節儀器參考條件測定，連續6 次，記錄天麻素色譜峰面積，計算6 次進樣色譜圖中天麻素峰面積RSD（n=6）為0.2%，該方法精密度良好。

（4）穩定性的考察實驗。取2.1.1 節試樣溶液，在室溫放置0，4，8，12，24，48 h 后，按2.1.2 節儀器參考條件測定，記錄天麻素峰面積，根據不同時間的天麻素峰面積，計算RSD 為0.6%（n=6），該方法試樣溶液在48 h 內穩定性好。

（5）重復性的考察實驗。取天麻洋參含片試樣（批號：20200909），精密稱取6 份，按2.1.1 節實驗溶液的制備方法制備試樣溶液，按2.1.2 節儀器參考條件測定峰面積，結果：記錄天麻素色譜峰面積，其RSD為0.8%，試樣天麻素的平均含量為 2.659 4 mg/g。本方法重復性好。

（6）準確度的考察實驗。采用加樣回收率法[15]，取已知含量的試樣9 份（批號：20200909，2.66 mg/g），按50%、100%、150% 量分別加入天麻素標準品，按2.1.1 節實驗溶液的制備方法配制低、中、高3 組濃度的試樣溶液，每1 制備濃度2 份，按2.1.2 節儀器參考條件測定天麻素含量，計算回收率。結果：天麻素平均回收率為97.6%（n=9）。試驗結果見表1。

表1 天麻素回收率測定結果表（n=9）

（7）限度確定。取天麻洋參含片試樣3 批，按已確定的方法測定每批含量。結果，3 批試樣天麻素平均含量為2.662 mg/g，相對偏差為1.5%。按3 批試樣天麻素平均含量約70%含量確定本品天麻素含量為不低于1.8 mg/g。

2.2 人參總皂苷含量測定

2.2.1 實驗溶液的制備方法

（1）試樣溶液的制備方法。取本品適量，研細，取細粉1 g，精密稱定，置100 mL 的容量瓶中，加適量水超聲處理30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，靜置10 min，吸取上清液1.0 mL，加入已處理好的中性氧化鋁與AmberLite-XAD-2 復合層析柱，分別用水、70%乙醇洗滌，收集70%乙醇洗滌液于蒸發皿中，60 ℃水浴揮干，加0.2 mL 5%香草醛冰乙酸溶液使殘渣溶解，再加入0.8 mL 高氯酸，轉入5 mL 具塞刻度離心管中，60 ℃水浴上加熱10 min，取出、放冷，準確加入冰乙酸5.0 mL，搖勻，即得。

（2）標準溶液的制備方法。精密稱取人參皂昔Re 20 mg，置25 mL 容量瓶中[7]，加甲醇溶解并稀釋至刻度，吸取100 μL 于蒸發皿中蒸干，按照2.2.1 節試樣溶液配制60 ℃水浴蒸干后，相同方法操作，即得。

（3）不含西洋參陰性試樣溶液的配制。除西洋參陰性試樣，按2.2.1 節實驗溶液的制備方法制成不含西洋參陰性試樣溶液。

2.2.2 測定波長的選擇實驗

取上述標準溶液、試樣溶液、陰性試樣溶液，在190～800 nm 波長范圍內進行紫外掃描。結果：560 nm 處，標準溶液、試樣溶液均有一個明顯的吸收峰，陰性試樣溶液未見吸收峰，故選定560 nm 為試樣的測定波長。

2.2.3 標準曲線的考察實驗

精密吸取標準溶液20、40、60、80、100、150、200μL，置于蒸發皿中，60 ℃水浴揮干，照2.2.1 節試樣溶液制備方法，在60 ℃水浴蒸干后同法操作，配制標準曲線溶液，按照紫外-可見分光光度法于560 nm 處測定吸光度，橫坐標為標準溶液濃度，縱坐標為吸光度進行線性回歸，計算標準曲線方程及其相關系數，線性回歸方程為y=0.482 1x-0.059 2，R2=0.999 5。人參皂苷在0.191～5.73μg的質量濃度范圍內的線性關系良好。

2.2.4 精密度的實驗考察

取供試品6 份，每份1.0 g，按上述2.2.2（1）節所述方法處理，記錄吸光度值，計算 RSD=0.82%，表明方法精密度良好。

2.2.5 準確度的實驗考察

采用加樣回收率法[15]，取已知含量的試樣9 份（0.5 g），分別加入50%、100%、150%的人參總皂苷，按2.2.1 節處理，測定各試樣的含量，計算回收率。結果：回收率在95.6%～98.2%，平均回收率為96.8%，RSD=0.9%。此方法的準確度高。（見表2）

表2 人參總皂苷準確度測定結果表（n=9）

2.2.6 限度制定

測定3 批天麻洋參含片試樣，其均值為1.031 31 mg/g，按70% 含量計算，則本品每100 g含總皂苷不低于720 mg。

3 結論

天麻和西洋參均是藥食同源品種。天麻中所含的天麻素是緩解疲勞的活性成分[10]。西洋參具有抗癌、抗缺氧和抗疲勞、抗糖尿病、鎮靜等多種藥理作用[11]。人參皂苷是西洋參的主要活性成分和重要質量控制指標[12]，其含量是人參的很多倍，具有抗疲勞、抗腫瘤等多方面的藥理活性[13]。天麻西洋參含片中天麻素和人參總皂苷含量的測定是保證產品質量、維護消費者合法權益的有效手段之一。

本文研究建立了適用于天麻洋參含片天麻素[14]含量測定的液相色譜法，該方法適用范圍廣、專屬性強，適用于以人參總皂苷為標準品，利用紫外可見分光光度法測定其總皂苷含量[15-16]。結果表明：本文的研究方法具有簡便、快速、重現性好等優點，是用于天麻素和總皂苷成分保健食品簡單、及時、有效的監測方法，為其標準制定提供了科學參考，可以滿足產品質量控制及市場監管的需求。