高效液相色譜法測定番茄醬中蘇丹紅I 的方法

◎梁 磊，陳春輝

（甘肅省張掖市質量檢驗檢測研究院，甘肅 張掖 734000）

蘇丹紅為親脂性偶氮化合物，包括Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四種，主要用于工業染色，因為我國食品藥品監督管理局禁止將蘇丹紅作為食品添加劑用于改變食品的外觀和色澤。在番茄制品中，番茄紅素[1]的含量是評判番茄制品等級的重要依據。但是，由于番茄紅素穩定性較差，不利于長期保存，考慮到其吸收波長與蘇丹紅較為接近，且番茄制品中番茄紅素含量的國家標準[2]以蘇丹紅[3]作為參考標準物質，所以，部分不法商戶為了牟取利益，以添加蘇丹紅的方式提高番茄紅素的檢測值。

作為食品中非法添加的蘇丹紅I 色素檢測方法主要包括高效液相色譜法（HPLC）[4-5]、超高效液相色譜-串聯質譜法（UPLC-MS）[6]和氣相色譜-質譜（GC-MS）法[7]等。其中液相色譜-串聯質譜法雖靈敏度高、分辨率好，但存在較強的基質效應，對前處理要求高，檢測成本較大；雖然已有報道采用免疫法[8]、電化學分析法[9]等新手段可以減少基質感染，獲得較為準確的結果，但因設備或相關標準的普及程度難以大規模應用。高效液相色譜法普及性好，同時在使用二極管陣列檢測器時可以通過光譜進行輔助定性，所以在蘇丹紅的檢測上得到了廣泛應用。本研究嘗試以高效液相色譜法為檢驗方法，通過優化樣品前處理方法，以期達到對番茄醬中蘇丹紅I 的準確檢驗，為日常監管與檢驗提供方法參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

番茄醬樣品均購自當地超市。蘇丹紅Ⅰ標準溶液（100 μg/mL，農業農村部環境保護科研監測所）；甲醇、乙腈、丙酮、正己烷、二氯甲烷（色譜純，天津市科密歐化學試劑有限公司）；中性氧化鋁（100～200 目，天津光復化學試劑公司）；實驗用水為密理博純水系統（美國）制得的超純水。

1.2 儀器與設備

LC-20A 型高效液相色譜儀（日本島津公司），配SPD-M20A 型光電二極管陣列檢測器和Labsolution工作站；SB25-120 型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；渦旋儀；ME204 型電子天平（梅特勒-托利多）；移液槍（賽默飛世爾）。

1.3 標準溶液的配置

蘇丹紅I 標準中間液（2.0 μg/mL）：用移液槍準確吸取500 μL 蘇丹紅I 標準溶液，以正己烷定容至25 mL。

蘇丹紅I 標準工作液的配置：分別用移液槍準確吸取蘇丹紅I 標準中間液0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 mL，將正己烷定容至1 mL，制成0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 的標準曲線工作液。

1.4 樣品的制備

精密稱取10 g 樣品，放入離心管，加入10 mL 水將其分散成糊狀，加入30 mL 正己烷：丙酮（3:1）混合溶液，渦旋5 min，4 000 r/min 離心10 min，吸出正己烷層，重復上述操作2 遍，合并3 次正己烷，加入無水硫酸鈉5 g 脫水，旋蒸至干，加5 mL 正己烷復溶，慢慢加入氧化鋁層析柱，待吸附完全后，使用正己烷10 mL 進行洗脫，棄去洗脫液，然后用5%丙酮正己烷50 mL 洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，加丙酮5 mL 復溶，過0.45 μm 濾膜后進樣。

1.5 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18 色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；進樣量10 μL；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min。檢測波長分別為478 nm。流動相A 為0.1%甲酸水-乙腈（85:15），流動相B 為0.1%甲酸乙腈-丙酮（80:20），截取15 min 采集數據。采用梯度洗脫，見表1。

表1 梯度條件表

2 結果與分析

2.1 色譜分離條件與檢測波長的選擇

通過比較乙腈-水、甲醇-水、水-乙腈-丙酮等體系，分離效果并未出現較大差別。但考慮食品樣品本身因制作工藝不同而導致的基質影響差異，所以在流動相中加入0.1%甲酸，讓整體流動相呈現酸性，來保證洗脫時的保留時間穩定性。通過光譜結果可知，蘇丹紅I 色素最大吸收波長出現在478 nm 處，且在該波長下被測物無干擾，故選擇該波長作為蘇丹紅I 的檢測波長。樣品檢測結果見圖1。

圖1 蘇丹紅1 樣品典型圖譜圖

2.2 樣品提取劑的確定

根據蘇丹紅I 的化學性質，其具有較強的脂溶性，所以在提取時，直接選擇具有弱極性的正己烷作為提取劑，一方面是增加蘇丹紅I 的提取效率，另一方面也避免了引入過多極性雜質，為后續凈化提供便利條件。

2.3 凈化方式的優化

因蘇丹紅I 化學結構中富含共軛結構，可以被氧化鋁所吸附，且正己烷可以在洗脫油脂等干擾組分的同時，保證被吸附的蘇丹紅I 不被洗脫，所以，蘇丹紅I 提取液凈化條件的選擇在相關標準中規定為采用降活處理的中性氧化鋁作為吸附劑，經正己烷淋洗去除油脂和其他雜質后，以5%丙酮正己烷溶液作為洗脫液進行洗脫。該方法中因氧化鋁活性因生產廠家不同存在一定差異，且烘干溫度與時間都會對其活化效率產生影響，加水降活操作也會因為檢驗人員操作習慣不同，存在降活不均勻，降活程度差異大等問題。所以，本方法采用105 ℃干燥2 h的充分活化方法，不進行加水降活處理，盡可能保證氧化鋁活性的一致性，提高實驗穩定性。同時在洗脫過程中，通過嘗試不同比例丙酮-正己烷溶液，最后確定為采用含有30%丙酮的正己烷溶液作為淋洗液。通過對比，干擾峰明顯減少，凈化效果良好，具體參見圖2。

圖2 未凈化（左）與經氧化鋁凈化（右）樣品譜圖

2.4 濾膜的選擇

在相關標準中，對于濾膜只規定為采用有機濾膜，但在實驗中發現，采用常見尼龍（Nylon）材質有機濾膜時，可以在過濾時看到濾膜上有明顯的紅色染料殘留，而聚四氟乙烯（PTFE）、聚偏二氟乙烯（PVDF）則無明顯吸附現象。考慮到日常其他實驗中的通用型，最終選擇PTFE 濾膜。

2.5 方法學驗證

2.5.1 線性方程、檢出限與定量限結果

對0.1、0.15、0.25、0.75、1.00 μg/mL 標準曲線工作液分別進樣，并進行線性擬合，得到線性方程：f（x）=38 313.3×x，擬合度R2=0.999 5，曲線現行良好。同時，以S/N=3 為檢出限（LOD），S/N=10 為定量限（LOQ）進行計算，得到該方法LOD 為7.4 μg/kg，LOQ為24.7 μg/kg，通過實際加標相近濃度驗證，也得到了相似結果。通過與國標進行比對，本方法測得的LOD 與LOQ 完全滿足常規檢測。

2.5.2 準確度、回收率與精密度結果

本方法進行三水平三平行加標驗證，分別稱取10 g空白基質，加入0.1 mL，0.5 mL，1 mL 濃度為10 μg/mL的蘇丹紅I 標準溶液，制成含0.1、0.5、1.0 μg/kg 的加標樣品，依照上文方法進行提取凈化后，對方法的回收率和精密度進行評估，其中低水平為線性范圍的最低點，準確度用加標水平的回收率評價。結果如表2 所示。

表2 加標回收率表

由表2 可知，該方法在線性范圍內，均具有較穩定的回收率，其平均回收率為92.61%，不同濃度范圍內RSD 在1.22%～3.41%，說明該方法的準確性良好。

取同一濃度標準品溶液（均取0.5 μg/mL），重復進樣6 次，測定其峰面積并計算RSD 值，結果小于2.0%，精密度良好。

3 結語

本試驗對番茄醬中蘇丹紅I 號檢驗方法進行了優化，通過對提取溶劑、檢測波長的選擇、流動相的優化，有效縮短了出峰時間，改善了峰形。同時，針對標準中中性氧化鋁柱填料活化/降活操作不穩定的問題，通過取消降活操作，優化淋洗液比例的方式，有效提高了凈化穩定性和凈化效果。通過實驗表明，該方法穩定性和準確性良好，精密度高，可以適用于番茄醬中蘇丹紅I 的日常檢測。