金鯧魚皮膠原蛋白肽改善光老化皮膚的作用研究

◎余 博

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)，安徽 安慶 230036）

金鯧魚，一種海洋經(jīng)濟(jì)魚類，是近年來我國華南地區(qū)具有代表性的海水養(yǎng)殖品種之一。金鯧魚皮中含有豐富的膠原蛋白，據(jù)廖偉等研究，采用酶解法提取的金鯧魚皮膠原蛋白主要屬于Ⅰ型膠原[1]；對比大鯢、鯉魚源的膠原蛋白，金鯧魚皮膠原蛋白具有更高的變性溫度，同時還含有大量與抗氧化性有關(guān)的疏水性氨基酸。我們推測這些差異可能使金鯧魚皮膠原蛋白具有更特殊的生物學(xué)活性。基于此，本文以金鯧魚皮為原料，制備膠原蛋白抗氧化肽，評價其體外抗氧化活性對光老化皮膚組織抗氧化能力及膠原蛋白合成的影響。

1 試驗方法

1.1 魚皮膠原蛋白肽的制備

用自來水清洗魚皮后，將其剪成小塊，堿液浸泡24 h 以去除油脂，蒸餾水沖洗至pH=9.5，使用脂肪酶及堿性蛋白酶處理5 h，沉淀物浸泡2 h，而后用0.01 M 檸檬酸浸泡至腫脹，90 ℃水浴提取3 h，過濾后濃縮，噴霧干燥即得膠原蛋白。配置20 mg/mL 膠原蛋白溶液，50 ℃下用0.5%膠原蛋白酶酶解5 h，滅酶后使用堿性蛋白酶與胰蛋白酶質(zhì)量比為1:4 的復(fù)合酶酶解5 h，滅酶后濃縮凍干，得到魚皮膠原蛋白肽粉末，密封保存。

1.2 金鯧魚皮膠原蛋白肽分子量的測定

以金鯧魚皮膠原蛋白肽以及上述標(biāo)準(zhǔn)品為原料，流動相分別配制5 mg/mL、1 mg/mL 的溶液，經(jīng)微孔過濾后進(jìn)樣。在0.5 mL/min 流速，214 nm 下進(jìn)行，取20 L 樣品溶液進(jìn)行分析。取得出的數(shù)據(jù)對數(shù)值，使用計算機(jī)進(jìn)行采集分析，與時間作標(biāo)準(zhǔn)曲線后計算得出金鯧魚皮膠原蛋白肽樣品的分子量[2]。

1.3 氨基酸組成分析

準(zhǔn)確稱取金鯧魚皮膠原蛋白肽30 mg，加入體積為10 mL、濃度為6 M 的鹽酸溶液（溶液中含有0.5%巰基乙醇），而后使用氮氣進(jìn)行封管處理，在110 ℃條件下水解22 h，用超純水將水解液稀釋到體積為10 mL，并從水解液中取出1 mL 并在60 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸干，再加入5～6 滴超純水洗滌、蒸干，重復(fù)3 次。然后加入0.02 M 鹽酸定容至5 mL，0.22 μm水膜層進(jìn)行過濾后的濾液放入液體瓶中，用氨基酸自動分析儀對上述過程處理后的濾液進(jìn)行測定。

1.4 DPPH 自由基清除率測定

分別將2 mL 金鯧魚皮膠原蛋白肽、羅非魚膠原蛋白肽、三文魚膠原蛋白肽以及2 mL 的0.15 mmol/LDPPH（以95%乙醇溶解）混合均勻。在黑暗中反應(yīng)30 min在517 nm 下測混合液吸光值，同時測定以等體積95%乙醇與樣液混合的吸光值，以及等體積95%乙醇與DPPH 混合液的吸光值。按式（1）計算金鯧魚皮膠原蛋白肽對DPPH 自由基的清除率：

1.5 ABTS 自由基清除率測定

ABTS 與過硫酸鉀混合在室溫、黑暗下反應(yīng)12～16 h。PBS 稀釋混合液至734 nm 檢測波長下吸光值為0.70±0.02。3.9 mL 稀釋液與0.1 mL 肽溶液混合反應(yīng)6 min 后，測量734 nm 處的吸光值。同條件下，PBS 代替肽溶液進(jìn)行反應(yīng)，測出吸光值。按公式計算金鯧魚皮膠原蛋白肽、羅非魚膠原蛋白肽、三文魚膠原蛋白肽溶液的ABTS 自由基清除率：

式中：為空白樣品在734 nm 檢測波長處的吸光值；是試樣在該檢測波長下的吸光度[3]。

1.6 還原力測定

將2.5 mL 肽溶液、2.5 mL pH=6.6 的磷酸鹽緩沖液、2.5 mL 1% 鐵氰化鉀溶液混合，并在50 ℃水浴20 min，冷卻后，加2.5 mL 10% 三氯乙酸，3 000 r/min 速度下離心10 min，取5 mL 上清液加入等體積超純水及1 mL 0.1%三氯化鐵溶液，測定其700 nm 處的吸光度值。肽溶液的還原力以吸光值表示。

1.7 動物實驗

以紫外線照射誘導(dǎo)建立光老化小鼠模型。用6%硫化鈉乙醇溶液對小鼠背部皮膚脫毛[4]。脫毛小鼠分為正常對照組（N）、模型組（M）和金鯧魚皮膠原蛋白肽高低劑量組（Tb-SCPH，Tb-SCPL），每組10 只小鼠。N、M 組都給予小鼠相同體積的生理鹽水；受試物高低劑量組分別灌胃300、600 mg/kg·d 的金鯧魚皮膠原蛋白肽，灌胃體積為1 mL/100 g·bw。光老化小鼠采用UVA 隔日照射的方式，前兩周，輻射劑量為最小紅斑劑量（MED），然后每周增加1 MED，4 MED 后保持不變，并采用紫外強(qiáng)度監(jiān)測儀記錄輻射量。末次灌胃0.5 h 后處死小鼠，取背部相同部位皮膚保存于-80 ℃?zhèn)溆肹5]。

1.8 皮膚中羥脯氨酸的測定

取皮膚組織約40 mg，130 ℃下封管水解4 h，移取0.5 mL 水解溶液，按照夏光華等的方法吸光值[6]，最后根據(jù)確定好的Hyd 標(biāo)準(zhǔn)曲線得出線性方程，并計算小鼠皮膚組織中Hyd 的濃度。

1.9 皮膚中抗氧化相關(guān)指標(biāo)測定

取皮膚組織適量，按照皮膚組織與生理鹽水1:9的比例進(jìn)行混合，使用離心機(jī)在7 000 r/min，4 ℃離心20 min，最后按試劑盒說明書測上清液中相關(guān)指標(biāo)。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，LSD 法對結(jié)果進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05，差異有顯著性，實驗結(jié)果用±s 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 Tb-SCP 對DPPH 自由基清除率的影響

自由基清除劑能提供電子與DPPH 單電子配對，使混合液在檢測波長處對光的吸收減少。圖1 為金鯧魚、三文魚、羅非魚魚皮膠原蛋白肽溶液對DPPH自由基清除率的影響。由圖1 可知，隨著肽溶液濃度增加，DPPH 自由基清除能力增強(qiáng)，且Tb-SCP 作用最顯著。在濃度為15 mg/mL 時，Tb-SCP 對DPPH 自由基的清除率達(dá)45.11%。

圖1 金鯧魚、三文魚、羅非魚魚皮膠原蛋白肽溶液對DPPH 自由基清除率的影響圖

2.2 Tb-SCP 對ABTS 自由基清除率的影響

ABTS 在氧化劑的作用下會成為藍(lán)綠色的ABTS 自由基，自由基清除劑作用下該過程受到抑制。檢測波長下吸光值的大小可間接反映肽溶液的抗氧化能力。圖2 表明隨著金鯧魚、三文魚、羅非魚的魚皮膠原蛋白肽濃度的增加，對ABTS 自由基的清除能力也變強(qiáng)。與前者相比，Tb-SCP 作用最為顯著，濃度15 mg/mL 時，清除率達(dá)93.97%。

圖2 金鯧魚、三文魚、羅非魚的魚皮膠原蛋白肽溶液對ABTS 自由基清除率的影響圖

2.3 Tb-SCP 對還原力的影響

溶液抗氧化能力可通過測定其還原能力來反映。通過測定肽溶液還原力可知，金鯧魚、三文魚、羅非魚的魚皮膠原蛋白肽溶液的還原力，都隨著濃度的增加而變大，三者中以Tb-SCP 的還原力最強(qiáng)，在溶液濃度為15 mg/mL 時，其吸光值達(dá)到了0.42。

2.4 Tb-SCP 對皮膚組織MDA 含量的影響

ROS 在體內(nèi)引起的過氧化使脂質(zhì)反應(yīng)為MDA，研究者往往通過測定組織內(nèi)MDA 含量反映組織受氧化造成損傷的程度，實驗中對照組MDA 含量較正常組增加了53.60%，說明紫外線照射造成了皮膚的氧化損傷，Tb-SCP 顯著地降低了小鼠皮膚中MDA 的含量，特別是高劑量組MDA 含量降低了28.70%，這些結(jié)果都表明Tb-SCP 能有效地抑制光老化皮膚中MDA 的含量，降低了小鼠體內(nèi)自由基的氧化反應(yīng)，減少了組織損傷。

2.5 Tb-SCP 提高皮膚組織羥脯氨酸含量

Hyp 是皮膚膠原蛋白合成的必需氨基酸，皮膚中羥脯氨酸含量變化可間接反映膠原蛋白的合成及含量情況，進(jìn)而反映皮膚衰老及恢復(fù)情況。實驗表明：模型組皮膚羥脯氨酸含量遠(yuǎn)低于正常組小鼠皮膚，這說明紫外線照射引起膠原蛋白降解，羥脯氨酸流失，皮膚衰老；而Tb-SCP 明顯提高了皮膚中羥脯氨酸含量，這也表明其有助于促進(jìn)小鼠的膠原蛋白合成和延緩皮膚光老化引起的皮膚衰老。

3 討論

不同的抗氧化方法可以從不同的方面反映抗氧化劑的抗氧化能力，并闡述相關(guān)的抗氧化機(jī)制，本文主要選取測定了肽溶液對DPPH 自由基、ABTS 自由基的清除率和還原力，從自由基清除和還原能力兩方面的抗氧化機(jī)制評價Tb-SCP 的抗氧化活性。結(jié)果表明：Tb-SCP 具有很強(qiáng)的自由基清除能力和還原能力。將從金鯧魚皮中提取的膠原蛋白肽與市場上常見的淡水魚種羅非魚及深海魚種三文魚進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)金鯧魚皮膠原蛋白肽在自由基清除及還原方面能力均強(qiáng)于另兩個，充分證明了金鯧魚膠原蛋白肽具有良好的抗氧化性。

Hyp 是皮膚的成纖維細(xì)胞在合成膠原時所必需的氨基酸。與光老化組對比，Tb-SCP 組Hyp 含量顯著增高，這說明TbSCP 干預(yù)后，組織中膠原蛋白合成增高，降解降低。Tb-SCP 作用下，體內(nèi)抗氧化體系的平衡得到恢復(fù)，我們推測自由基所阻斷的TGF-β/smad 信號通路在Tb-SCP 的干預(yù)下得到了緩解，該通路中的重要因子TGF-β1 可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖。同時，該通路的恢復(fù)將指導(dǎo)體內(nèi)膠原蛋白合成增多，從而改善了皮膚光老化帶來的皮膚衰老問題。

4 結(jié)語

通過酶解法制備的Tb-SCP 分子量集中分布在500 Da，且具有良好的抗氧化能力。在體外可以有效清除自由基，在體內(nèi)具有良好的促進(jìn)體內(nèi)抗氧化體系平衡的作用。能提高光老化小鼠皮膚組織中GSH-Px、CAT 和SOD 的活力，降低MDA 含量，提高Hyp 含量，促進(jìn)膠原蛋白合成和抑制膠原蛋白降解，從而延緩光老化引起的皮膚衰老，是一種可供開發(fā)利用的抗光老化材料。