茯苓多糖對癲癇大鼠海馬神經細胞凋亡及Nrf2ARE信號通路的影響

梁靜 陳漢仁 毛敏蕓 蔣靜子 彭天嬋

癲癇是最常見的神經系統疾病之一，影響全球超過7 000萬人，給患者、護理人員和社會帶來巨大的身體、心理、社會和經濟負擔[1]。盡管癲癇研究取得了實質性進展，但約35%的癲癇患者對抗癲癇藥有抗藥性，并長期經歷反復自發性癲癇發作[2]。據報道，癲癇持續狀態會導致線粒體呼吸鏈功能障礙并導致能量衰竭，進而加劇氧化應激的嚴重程度，并導致海馬神經元損傷或死亡[3]。因此，從抑制氧化應激，降低海馬神經細胞凋亡的角度開發新的藥物，對于癲癇的治療具有重要的意義。茯苓多糖 (polysaccharides of poria cocos，PPC)來源于真菌茯苓的菌核,具有抗腫瘤、抗炎、抗氧化等多種生物活性[4]。有研究顯示，PPC可抑制神經元凋亡，進而發揮對1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶誘導的帕金森小鼠黑質多巴胺能神經元的保護作用[5]。本研究主要探討PPC對癲癇大鼠海馬神經細胞凋亡的影響以及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 60只SPF級SD大鼠購自廣州賽業百沐生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(粵)2020-0055，大鼠均在標準條件下飼養。動物實驗均遵循3R原則，本研究得到醫院動物倫理委員會的批準。

1.2 主要試劑 茯苓購自廣印堂中藥股份有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、還原型谷胱甘肽(GSH)檢測試劑盒均購自北京索萊寶生物科技有限公司；兔源一抗活化的Caspase-3(Cleaved-Caspase-3)、Bax、核因子E2相關因子2 (Nrf2)、血紅素氧化酶 (HO-1)、醌氧化還原酶1(NQO-1)、β-actin及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗均購自天馳生物科技有限公司；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購自碧云天生物有限公司。

1.3 PPC的制備 參照文獻[6]，用95%乙醇脫脂，水提醇沉法提取，沉淀出的多糖經Sevag法除蛋白后透析，冷凍干燥，即可得到粗多糖提取物。

1.4 癲癇大鼠模型的構建及動物分組 隨機選取48只大鼠構建癲癇大鼠模型，剩余12只作為NC組。參照文獻[7]進行癲癇模型構建：將大鼠按照127 mg/kg的劑量腹腔注射氯化鋰，20 h后按照1 mg/kg的劑量皮下注射東莨菪堿，30 min后按照50 mg/kg的劑量腹腔注射毛果蕓香堿。NC組大鼠腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液。通過Racine分級[8]判定癲癇發作級別，4級持續>30 min進入癲癇持續狀態則認為造模成功。造模成功后，將癲癇大鼠模型隨機分為Model組、茯苓多糖低劑量組(PPC-L組)、茯苓多糖中劑量組(PPC-M組)、茯苓多糖高劑量組(PPC-H組)，每組12只。參考文獻[9,10]及前期預實驗結果，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠分別按照50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg的劑量灌胃PPC，1次/d，連續14 d。NC組和Model組灌胃等量的0.9%氯化鈉溶液。

1.5 大鼠癲癇發作潛伏期測定 觀察并記錄5組大鼠末次給藥12 h至首次出現>4級癲癇的發作時間。

1.6 Morris水迷宮實驗[7](1)學習能力：將大鼠放到任意一入水點，將其游到平臺的時間記為逃避潛伏期，如果在120 s內不能游到平臺，就引導其爬到平臺，連續訓練5 d，記錄第6天的逃避潛伏期。(2)空間記憶能力：第7天撤去平臺，以距平臺最遠的地方為入水點，觀察并記錄大鼠120 s內穿越平臺的次數。

1.7 氧化應激指標SOD、CAT、GSH水平的測定 嚴格按照SOD、CAT、GSH試劑盒說明書操作步驟測定大鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH水平。

1.8 TUNEL染色檢測大鼠海馬神經細胞凋亡 將海馬組織切片脫蠟至水，加入3%H2O2及蛋白酶K孵育30 min后，再加入 50 μl TUNEL反應混合物，在37℃下孵育60 min。最后加入 DAPI 染色10 min，應用倒置顯微鏡觀察細胞凋亡情況。細胞凋亡率(%)=(染色陽性細胞數目/細胞總數)×100%。

1.9 Western blot檢測蛋白表達 RIPA裂解緩沖液裂解并提取大鼠海馬組織中的總蛋白。BCA試劑盒測定蛋白質濃度，經電泳、轉膜、封閉后，添加一抗Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1、β-actin，均為1∶2 000稀釋，在4℃下孵育過夜，然后與HRP偶聯的羊抗兔二抗(1∶1 000)孵育1 h后，通過Image J 軟件分析蛋白質條帶灰度值。

2 結果

2.1 PPC對大鼠癲癇發作潛伏期的影響 NC組大鼠沒有癲癇發作的跡象，與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠癲癇發作潛伏期延長，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 5組大鼠癲癇發作潛伏期比較

2.2 PPC對大鼠學習與記憶能力的影響 與NC組比較，Model組逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表2。

表2 5組大鼠逃避潛伏期及穿越平臺次數比較

2.3 PPC對大鼠海馬組織中氧化應激指標的影響 與NC組比較，Model組CAT、SOD、GSH水平明顯降低(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組CAT、SOD、GSH水平明顯升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 5組大鼠海馬組織中氧化應激指標SOD、CAT、GSH水平比較

2.4 PPC對大鼠海馬神經細胞凋亡的影響 與NC組比較，Model組海馬神經細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠海馬神經細胞凋亡率顯著降低，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖1，表4。

NC組 Model組 PPC-L組 PPC-M組 PPC-H組

表4 5組大鼠海馬神經細胞凋亡率比較

2.5 PPC對5組大鼠海馬組織中凋亡蛋白及(Nrf2)/抗氧化反應元件 (antioxidant response element，ARE) 通路蛋白表達的影響 與NC組比較，Model組Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達明顯升高(P<0.05)，Nrf2、NQO-1、HO-1蛋白表達明顯降低(P<0.05)；與Model組比較，PPC-L組、PPC-M組、PPC-H組大鼠海馬組織中Cleaved-Caspase-3、Bax蛋白表達降低(P<0.05)，Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達升高，且呈劑量依賴性(P<0.05)。見圖2，表5。

圖2 western blot檢測Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達；A NC組；B Model組；C PPC-L組；D PPC-M組；E PPC-H組

表5 5組大鼠海馬組織中Cleaved-Caspase-3、Bax、Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達比較

3 討論

癲癇的主要特征是反復發作和一系列神經行為合并癥，包括認知障礙和社會適應行為異常[11]。研究表明，氧化應激與癲癇的進展及嚴重程度密切相關[12]。海馬組織是對學習和記憶至關重要的大腦區域，其神經元損傷可引起認知功能障礙[13]。癲癇發作后，可引起海馬組織神經元損傷[14]。本研究發現大鼠存在癲癇行為，逃避潛伏期延長，穿越平臺次數減少，說明癲癇大鼠模型存在認知功能障礙。SOD、CAT、GSH均為抗氧化酶，在機體中具有清除自由基的作用，其水平高則表明氧化應激受到抑制[15]。本研究發現，與NC組比較，Model組大鼠海馬組織中SOD、CAT、GSH水平顯著降低，海馬神經細胞凋亡率及凋亡相關蛋白表達顯著升高，提示在癲癇大鼠模型中氧化應激增強，海馬神經細胞凋亡升高。

近年來，關于PPC在改善機體氧化應激、細胞凋亡方面的研究越來越多。如PPC提取物對小鼠酒精性肝損傷具有保護作用，其機制與抑制TLR4/NF-κB炎癥信號通路，減輕氧化應激和炎癥損傷有關[16]；PPC能增強腎臟抗氧化性,保護自由基介導的氧化損傷，可以治療或延緩糖尿病腎病的發生[17]；PPC對四氯化碳誘導的小鼠肝損傷具有保護作用，其機制可能與增強肝臟抗氧化能力及減輕炎癥有關[18]；PPC能抑制2型糖尿病小鼠腎組織中Bax基因過多表達，使糖尿病狀態下腎組織細胞凋亡趨勢受到抑制[19]。但關于PPC對癲癇大鼠氧化應激及神經細胞凋亡的影響筆者尚未見報道。本研究結果顯示，與Model組比較，PPC低、中、高劑量組大鼠癲癇發作潛伏期延長，逃避潛伏期縮短，穿越平臺次數增加，海馬組織中SOD、CAT、GSH水平顯著升高，海馬神經細胞凋亡率顯著降低，提示PPC可能通過提高抗氧化酶活性抑制氧化應激，從而減少神經細胞凋亡，進而發揮對癲癇大鼠的神經保護作用。

Nrf2 是抗氧化防御系統中的重要調節劑，其可與ARE結合形成Nrf2-ARE復合體，激活HO-1、NQO-1等具有抗氧化能力的酶[20]。相關研究報道，辛伐他汀通過激活Nrf2/ARE通路增強Nrf2和HO-1表達，發揮抗氧化作用、抑制細胞凋亡，實現對急性肺損傷大鼠的保護作用[21]；白藜蘆醇通過其抗氧化作用抑制了草酸鈣晶體對大鼠腎小管上皮細胞的損傷及黏附，此作用可能與激活Nrf2/ARE信號通路有關[22]。本研究結果顯示，與NC組比較，Model組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達水平顯著降低，提示Nrf2/ARE信號通路可能參與了癲癇大鼠的氧化應激及神經細胞凋亡過程；與Model組比較，PPC低、中、高劑量組大鼠海馬組織中Nrf2、HO-1、NQO-1蛋白表達水平顯著升高，且呈劑量依賴性，提示PPC可能通過激活Nrf2/ARE信號通路抑制氧化應激，減少神經細胞凋亡，發揮抗癲癇作用。

綜上所述，PPC可抑制氧化應激，減少神經細胞凋亡，發揮抗癲癇作用，該機制可能與激活Nrf2/ARE信號通路有關。