還原谷胱甘肽對成纖維滑膜細胞中內脂素的影響

尚 辰，郝文婷，任義樂

（徐州市第一人民醫院，江蘇 徐州 221000）

類風濕關節炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種典型的慢性自身免疫性疾病，其特征是關節呈進行性對稱性破壞并伴有全身炎癥反應[1]。該病與幾種代謝性疾病和心血管疾病等共病高度相關[2]。值得注意的是，先天性危險因素（如遺傳、性別和年齡）和獲得性危險因素（如肥胖、吸煙和創傷）與RA 的分解代謝及炎癥過程有關[3-5]。幾種脂肪來源的細胞因子，如瘦素、脂聯素和內脂素在局部或全身水平的紊亂，對RA 的炎癥和分解代謝改變起著重要作用[3]。其中內脂素是一種新型的脂肪因子，已有研究發現其是炎癥和代謝過程中的關鍵調控因子。內脂素也被稱為煙酰胺磷酸核糖基轉移酶（NAMPT），是哺乳動物中煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）生物合成補救途徑中的限速酶。NAD+ 是一種普遍存在的參與氧化還原反應的輔酶，在氧化應激條件下，需要增加NAD+ 的再生，因此，內脂素作為NAD+ 代謝的調節因子在基本細胞過程中占有關鍵地位[6]。谷胱甘肽（GSH）是人體內最重要的抗氧化物質，前期研究[7]已證明GSH可能通過降低成纖維滑膜細胞中的活性氧（ROS）水平進一步抑制炎癥因子的釋放，本試驗進一步研究其對脂肪因子中內脂素的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

MH7A 細胞系（購自上海觀道生物科技有限公司）；健康清潔級雌性DBA/1J 小鼠14 只（購自常州卡文斯實驗動物有限公司），7 ～8 周齡。

1.2 試劑與儀器

GSH（北京索萊寶科技有限公司）；牛Ⅱ型膠原（Chondrex 公司，貨號：2002-2）；弗氏完全佐劑（含卡介苗，CFA，Chondrex 公司）；弗氏不完全佐劑（不含卡介苗，IFA，Chondrex 公司）；1640 培養基（SH30265.01，美國Hyclone）；低糖DMEM 培養基（SH30021.01B，美國Hyclone）；胎牛血清（FBS，10100147，美國Gibco）；青- 鏈霉素溶液（15140，美國Gibco）；內脂素ELISA 試劑盒（eBioscience 公司）；逆轉錄試劑盒（日本Takara Bio Inc.）；熒光定量PCR 儀（ABI7500）。

1.3 膠原誘導關節炎（CIA）模型制備

將14 只雌性DBA/1J 小鼠隨機分為CIA+PBS 組、CIA+GSH 組。將牛Ⅱ型膠原與CFA 等體積混合乳化制成混懸乳劑，在無菌條件下以每只0.1 mg 的劑量在小鼠尾根部皮下注射，首免當日記為1 d。在21 d將牛Ⅱ型膠原與IFA 等體積混合乳化，再次注射于小鼠尾根部皮下，劑量同前。CIA+GSH 組自第1 d 至第50 d 通過灌胃給予500 mg/kg GSH，CIA+PBS 組同時每日給予等量PBS 灌胃處理。所有小鼠均正常飼養于無特定病原體（SPF）環境。

1.4 小鼠骨髓來源單核巨噬細胞（Bonemarrowderivedmacrophages，BMDM）分離培養

首免50 d 后處死兩組小鼠，取出后肢股骨及脛骨，剝離骨表面肌肉和軟組織，去除股骨和脛骨骨骺端，將骨髓從骨髓腔中沖出，制成細胞懸液。以1640 完全培養基（1640 培養基+10% FBS+1% 青-鏈霉素溶液+10% L929 細胞培養上清）重懸細胞后種于6 孔板中。細胞貼壁后直至其長滿，每3 d 換液1 次，此時的貼壁細胞為BMDM。

1.5 轉錄組學測序

將BMDM 細胞送往廣州基迪奧生物科技有限公司進行轉錄組學測序，提取總RNA，并質檢合格，建立文庫。獲得原始測序短序列，經過濾得到短序列Clean Reads 為有效數據。采用DESeq2 軟件進行差異表達分析（P＜0.05），篩選出兩組間差異表達基因（Differentially expressed genes，DEGs），進行基因本體（Gene ontology，GO）功能顯著性富集分析。

1.6 MH7A 細胞分組

將MH7A 細胞分為PBS 組、GSH 組（GSH 100 μg/mL）、LPS（100 ng/mL）組、GSH+LPS 組，處理24 h 后收集細胞以及細胞上清。

1.7 收集MH7A 細胞，按照Trizol 試劑的說明書從中提取總RNA

測定RNA 濃度后每個樣本取1 μg 進行反轉錄。反轉錄體系和試驗方法參照說明書。根據SYBR說明書進行后續的實時定量PCR（qPCR）檢測內脂素、瘦素、脂聯素。內脂素上、下游引物序列分別為5’-CGACTCCTACAAGGTTACTCACTATAAAC-3’和 5’-CTTCTCAAGAATGTAGTTCCATCCC-3’，瘦 素 上、 下 游 引 物 序 列 分 別 為5’-TGGTTTCATTTCTACTGTGACTGATG-3’ 和5’-TCCTAAGCAATTGCAGAAGATAAG-3’， 脂 聯素上、下游引物序列分別為5’-CCCCAACATGC-3’和5’-TACACCTGGAGCCAGACTTGG-3’。得到CT值，以GAPDH 為內參，用2-ΔΔCt 計算分析mRNA相對表達量。

1.8 ELISA 檢測細胞上清中內脂素的表達情況

根據eBioscience 公司生產的ELISA 檢測試劑盒說明書檢測細胞上清內脂素的表達情況。

2 結果

2.1 GSH 干預對LPS 誘導的MH7A 成纖維滑膜細胞中內脂素、瘦素、脂聯素、抵抗素mRNA 表達的影響

我們采用RT-PCR 檢測細胞內脂素、瘦素、脂聯素、抵抗素mRNA 表達，結果顯示與LPS 組相比，LPS+GSH 組細胞中內脂素、瘦素、脂聯素、抵抗素mRNA 水平均顯著下降（P＜0.05）。見圖1。

圖1 GSH 干預對LPS 誘導的MH7A 成纖維滑膜細胞中內脂素、瘦素、脂聯素、抵抗素mRNA 表達的影響

2.2 GSH 干預對MH7A 成纖維滑膜細胞上清內脂素蛋白表達的影響

與LPS 組相比，LPS+GSH 組的細胞上清內脂素蛋白水平顯著降低。見圖2。

圖2 GSH 干預對MH7A 成纖維滑膜細胞上清內脂素蛋白表達水平的影響

2.3 GSH 干預對CIA 鼠BMDM 內脂素mRNA表達的影響

GSH 干預對CIA 鼠BMDM 內脂素mRNA 表達的影響見表1。

表1 CIA+GSH vs CIA+PBS 差異基因

3 討論

在過去的幾年中，有研究表明代謝因素特別是脂肪組織和脂肪細胞產生的大量脂肪因子，參與了RA的炎癥過程。脂肪因子相互作用，部分相互誘導，形成脂肪因子網絡，對滑膜炎癥以及軟骨、骨侵蝕起到一定的促進作用[8]。本研究發現，相比于正常對照組，LPS 刺激MH7A 細胞后多種脂肪因子表達升高，如內脂素、瘦素、脂聯素、抵抗素，這與既往的研究結果相一致。給予GSH 干預后可顯著下調脂肪因子的表達。GSH 能夠改變脂肪因子表達的原因可能是基于其生物學特性。GSH 是由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成的一種三肽，含有巰基（-SH），它是甘油醛磷酸脫氫酶的輔基，又是乙二醛酶及丙糖脫氫酶的輔酶，參與體內三羧酸循環及糖代謝。GSH 廣泛分布于機體各器官內，它是多種酶的輔酶，能激活多種酶，影響糖、脂肪、蛋白質的代謝，為維持細胞的生理功能提供能量[9]。本研究中我們進一步研究了GSH 干預對內脂素表達的影響。內脂素是一種新型的脂肪因子，是炎癥和代謝過程的關鍵調控因子[4]。它又被稱為NAMPT，是細胞質中NAD+ 前體的催化物，也是哺乳動物特異性NAD+ 挽救途徑中的限速酶。內脂素的催化活性促使煙酰胺（NA）在細胞質中合成煙酰胺單核苷酸（NMN）。NMN 隨后被轉運到線粒體，通過NMN 腺苷轉移酶（NMA）轉化為NAD+。NAD+及其磷酸化形式NADP 被認為是其作為普遍信號傳導和能量分子的生命必需品。內脂素對NAD+ 的調控意味著任何NAD+ 依賴的基本過程，如細胞氧化還原電位、氧化應激、聚合酶、環化酶和蛋白表達、細胞黏附或衰老都可以通過內脂素調控。

有一項薈萃分析研究[10]和幾項獨立研究[11-18]表明RA 患者血清以及外周血中單個核細胞可表達更高的內脂素，內脂素基礎水平與抗環瓜氨酸肽抗體和RA 放射學進展呈正相關。此外，在初治RA 患者中還觀察到血清內脂素水平與疾病活動性相關。有學者在RA 動物模型中研究了內脂素抑制劑FK866 的作用，發現通過藥理抑制消耗內脂素可以降低RA 的嚴重程度和炎癥因子的分泌[19]。本研究中我們發現與對照組相比，LPS 組的MH7A 細胞中內脂素mRNA 水平以及細胞上清內脂素蛋白水平均升高，而通過GSH干預可明顯下調細胞中內脂素mRNA 以及細胞上清的內脂素蛋白水平。NAD（P）+/NAD（P）H 和GSH/GSSG 是人體重要氧化還原對，炎癥激活期間產生的ROS 可誘導細胞中的DNA 損傷，導致NAD+ 池的消耗，NAD+ 維持糖酵解通量和炎癥功能需要通過激活NAMPT 進行補救[20]。而我們給予GSH 干預，提高了細胞的抗氧化能力，降低了ROS 水平，從而下調了NAMPT 的表達。我們在CIA 大鼠模型中的實驗結果也驗證了經GSH 干預，巨噬細胞中的內脂素明顯下降。結合我們此前的研究結果——GSH 可下調MH7A細胞中白細胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、基質金屬蛋白酶-3（MMMP-3）等的表達，我們推測GSH 可能部分通過降低內脂素的表達從而調控炎癥。但其機制需要進一步研究，深入探討GSH參與RA 發生的詳細機制，有望為新型靶點藥物的研發提供新視角。