食品中類固醇激素基體標準物質(zhì)研究進展

吳利君 尹 營 戴麗雪 余麗波 李 存 彭 濤

(1.天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100176；3.山東國潤環(huán)境檢測有限公司，山東 泰安 271000)

類固醇激素(Steroid Hormones)，又稱為甾體激素[1]，可分為腎上腺皮質(zhì)激素和性激素兩大類[2]，具有較強的生物活性和內(nèi)分泌干擾效應[3]，可提高動物的繁殖生長效率，降低生產(chǎn)成本。違規(guī)使用類固醇激素會導致動物組織及產(chǎn)品相關激素殘留超標，人體食用后易引起不良反應甚至造成機體不可逆損傷，還會間接污染環(huán)境[4]。為有效避免食品安全風險，準確有效的檢測方法具有重要意義?；w標準物質(zhì)可以反映藥物及其產(chǎn)物在動物機體內(nèi)的代謝情況，模擬目標物與基質(zhì)的實際結(jié)合狀態(tài)，減小基質(zhì)效應的影響[5]，檢測過程中使用基體標準物質(zhì)可有效提升檢測結(jié)果的準確性和真實性以及數(shù)據(jù)的可溯源性，同時還可使用基體標準物質(zhì)對檢測人員能力、試劑和儀器、實驗室環(huán)境等影響因素進行評價，進一步提升檢測的可靠性,從多方面保障食品安全質(zhì)量。

目前有較多科研計量機構(gòu)對不同類別的基體標準物質(zhì)進行了研制生產(chǎn)，歐盟已明確規(guī)定了在獸藥殘留分析中可使用基體標準物質(zhì)。但由于中國的相關研究起步晚，較國外的研制水平和基體標準物質(zhì)種類、數(shù)量等存在一定差距，固醇類激素基體標準物質(zhì)數(shù)量更為稀少。研究擬對基體標準物質(zhì)的分類、特性、研制流程以及應用進行總結(jié)，對目前中國已研制的食品中類固醇激素基體標準物質(zhì)進行介紹，并分析中國基體標準物質(zhì)研制發(fā)展中存在的問題和發(fā)展前景，旨在為中國激素類物質(zhì)食品基體標準物質(zhì)的研制提供依據(jù)。

1 基體標準物質(zhì)概述

1.1 基體標準物質(zhì)的定義及分類

根據(jù)JJF 1005—2005《標準物質(zhì)常用術語和定義》，標準物質(zhì)(Reference Material，RM)是一種已經(jīng)確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值，用以校準測量裝置、評價測量方法或給材料賦值的材料或物質(zhì)。附有相關資質(zhì)證書的標準物質(zhì)為有證標準物質(zhì)，中國有證標準物質(zhì)可分為一級標準物質(zhì)(GBW)、二級標準物質(zhì)[GBW(E)][6]?；w標準物質(zhì)(Matrix Reference Material，MRM)是具有實際樣品特性的標準物質(zhì)，重現(xiàn)目標物與基質(zhì)結(jié)合狀態(tài)，與預期測量樣品特性相同或相近，有效減小基質(zhì)效應，從而對方法進行質(zhì)量控制[7]。

根據(jù)制備工藝、適用范圍、原料等，食品基體標準物質(zhì)可分為天然基體標準物質(zhì)和添加基體標準物質(zhì)。天然基體標準物質(zhì)是在原料農(nóng)產(chǎn)品種植或食源性動物飼養(yǎng)過程中依據(jù)藥物的使用周期或短期給藥，采集目標基質(zhì)獲得陽性樣品，可以反映藥物違規(guī)使用后真實的代謝或殘留情況，但其制備周期長，成本較高；添加基體標準物質(zhì)是通過在相應的陰性基質(zhì)中添加一定濃度的目標物制成陽性樣品，模擬了相關食品成分、污染物、營養(yǎng)物質(zhì)在食品中呈現(xiàn)的狀態(tài)，能滿足檢測、校正的基本要求，同時具有制備周期短、均勻性良好、目標物濃度易于控制等優(yōu)勢[8-9]。

1.2 基體標準物質(zhì)的特性

根據(jù)ISO Guide 35—2006，標準物質(zhì)應具備均勻性、穩(wěn)定性、溯源性3種特性。均勻性是指與物質(zhì)有一種或多種特性相關的具有相同結(jié)構(gòu)或組成的狀態(tài)[10]，通常分為瓶間均勻性和瓶內(nèi)均勻性；穩(wěn)定性是指標準物質(zhì)在一段時間內(nèi)特征參考量的變化情況，包括長期穩(wěn)定性和短期穩(wěn)定性，用于反映運輸和最大貯藏期的變化情況[11]；溯源性是指通過一條具有規(guī)定不確定度的不間斷的比較鏈，使測量結(jié)果或測量標準值能與國家測量標準或國際測量標準聯(lián)系起來的特性[12-13]。

1.3 基體標準物質(zhì)的研制

基體標準物質(zhì)由于需要考慮目標物、基體等多種影響因素，其研制過程主要包括依據(jù)目標物選擇原料基質(zhì)、建立分析方法、基體標準物質(zhì)的制備、均勻性評估、穩(wěn)定性評估、定值、不確定度評估等，具體研制技術路線如圖1所示。

圖1 基體標準物質(zhì)研制技術路線

1.3.1 基質(zhì)的篩選 研制過程中，基體標準物質(zhì)的基質(zhì)選擇依據(jù)主要包括實際使用過程中的應用價值和目標物質(zhì)。近年來，大多基體標準物質(zhì)被應用于食品安全問題，因此主要以果蔬凍干粉以及動物源性食品作為基質(zhì)；依據(jù)目標物質(zhì)選擇基質(zhì)時需考慮的因素相對復雜，不僅要考慮到目標物可能出現(xiàn)或污染的基質(zhì)，還應考慮目標藥物是否在動植物體內(nèi)存在分解代謝等情況，以獸藥基體標準物質(zhì)為例，不易分解的藥物多污染動物肌肉和部分內(nèi)臟組織，在動物體內(nèi)代謝的藥物一般選取內(nèi)臟和蛋、奶等產(chǎn)物為基質(zhì)。

1.3.2 基體標準物質(zhì)的制備 基體標準物質(zhì)在制備過程中為保證特征值檢驗和定值的準確性，應充分考慮目標物質(zhì)和基質(zhì)的相關性質(zhì)從而確定制備工藝和流程。由于大多基體標準物質(zhì)均需要大量制備，原料數(shù)量相對較大，因此需要將多份陽性原料充分打碎、攪拌混合以保證制備過程中以及后期成品的均勻性。此外，為保證基體標準物質(zhì)的穩(wěn)定性，需要根據(jù)目標物質(zhì)性質(zhì)盡可能避免水分、光照等因素的影響，多數(shù)固態(tài)樣品采用冷凍干燥技術制成凍干粉并采用鋁箔袋充入惰性氣體或真空分裝，液態(tài)樣品則大多混勻后使用棕色西林瓶進行封裝。

1.3.3 均勻性檢驗 均勻性是標準物質(zhì)的特征值之一，分為瓶間均勻性和瓶內(nèi)均勻性。均勻性檢驗是對分裝后單瓶樣品內(nèi)或不同樣品間進行檢測，通過測量結(jié)果是否在規(guī)定不確定范圍內(nèi)判斷特性量值的均勻程度。隨機取樣的個數(shù)一般為10個或10個以上。均勻性研究的常用方式是單因素方差分析法，其他方法包括平均值的一致性檢驗法、極差法等[14]。影響均勻性的因素包括檢測方法的重復性和靈敏度、抽樣方法、測量順序等，但制備階段對均勻性起決定性作用，合適的原料、正確的制備工藝以及制備人員的能力可大大提高標準物質(zhì)的均勻性。

1.3.4 穩(wěn)定性檢驗 穩(wěn)定性是指標準物質(zhì)在規(guī)定的時間間隔和環(huán)境條件下，其特性量值保持在規(guī)定范圍內(nèi)的能力[15]。通常用短期穩(wěn)定性和長期穩(wěn)定性對標準物質(zhì)進行評定。短期穩(wěn)定性是在指定的運輸條件下運輸期間標準物質(zhì)特性的穩(wěn)定性，受包裝條件、運輸方式以及溫度的影響；長期穩(wěn)定性是在有證標準物質(zhì)證書中所要求的特定貯藏條件下具有標準物質(zhì)特性的穩(wěn)定性，代表標準物質(zhì)的有效期[16]。有證標準物質(zhì)的短期穩(wěn)定性檢測一般持續(xù)1～2個月，長期穩(wěn)定性一般為24～36個月，選取5～6個時間點進行檢測[17]。物理因素、化學因素以及生物因素都會對標準物質(zhì)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。標準物質(zhì)的貯藏環(huán)境、運輸條件、包裝方式需根據(jù)不同藥品和基質(zhì)的理化性質(zhì)進行確定。標準物質(zhì)在運輸貯藏過程中應處在避光、低溫、真空、惰性氣體等環(huán)境下以保持標準物質(zhì)的特征值，提高標準物質(zhì)的穩(wěn)定性。

1.3.5 定值 根據(jù)JJF 1005—2005標準物質(zhì)常用術語和定義，定值是對與標準物質(zhì)預期用途有關的一個或多個物理、化學、生物學或工程技術等方面的特性值的測定。均勻性研究完成且均勻性符合要求后可進行定值，定值方法的確認要根據(jù)預期準確度以及不同方法的選擇性、檢出限、靈敏度等參數(shù)以及預期用途和方法成熟度等進行選擇，方法確認的實施環(huán)境應在定值的條件下進行[18]。

標準物質(zhì)的定值方法包括：單一實驗室采用單一基準方法定值；單一實驗室采用兩種或多種不同原理的獨立參考方法定值；多家實驗室使用一種或多種以證明準確性的方法合作定值；利用特定方法定值；利用一級標準物質(zhì)比較定值[19]。

1.3.6 不確定度評定 標準物質(zhì)的不確定度又稱測量不確定度，用來表現(xiàn)測量結(jié)果的分散程度。在標準物質(zhì)的研制測量過程中，不確定度由均勻性不確定度、穩(wěn)定性不確定度、定值不確定度3部分組成[20]。定值時采用基準方法，當均勻性及穩(wěn)定性檢驗測量方法與定值方法不一致時，分析引入均勻性和穩(wěn)定性的不確定度十分重要。合成標準不確定度為定值不確定度、均勻性不確定度、穩(wěn)定性不確定度平方和開方的疊加組成，合成標準不確定度乘以包含因子得出擴展不確定度也稱為總不確定度，該因子的數(shù)值需>1。定值不確定度由A類不確定度和B類不確定度構(gòu)成，A類不確定度為規(guī)定測量條件下測得的量值按照統(tǒng)計分析的方法進行的不確定度分量的評定(包括重復性測量條件、期間精密度測量條件或復現(xiàn)性測量條件)；B類不確定度為權威機構(gòu)發(fā)布的量值、標準物質(zhì)的量值、校準證書、儀器漂移、測量儀器的準確度等級等。

1.4 基體標準物質(zhì)的應用

中國的基體標準物質(zhì)資源相對豐富，隨著近年來分析手段的不斷進步，人們逐漸提高了對基體標準物質(zhì)的認知重視程度。基體標準物質(zhì)的普遍應用包括保存和傳遞特性量值并建立測量溯源性[21]，標準物質(zhì)作為測量標準，其特性值應能溯源到合適的單位或參考測量標準；保證測量結(jié)果的一致性和可比性[22]，通過檢測結(jié)果的反饋對相關實驗室儀器校準、性能、試驗操作人員、實驗室環(huán)境等進行能力評價；評估目標物的相關分析方法，在試驗條件相同的情況下判斷試驗方法的重復性、準確性、可再現(xiàn)性等，根據(jù)試驗結(jié)果優(yōu)化試驗方法；保障和提高產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督水平，切實發(fā)揮基體標準物質(zhì)的在人們健康保障和社會經(jīng)濟發(fā)展中的應用價值。中國現(xiàn)行基體標準物質(zhì)共有13類[23]，自主研制及復制的基體標準物質(zhì)已被應用至食品、化工、醫(yī)學、環(huán)境等多個領域。

醫(yī)學領域中，基體標準物質(zhì)主要用于藥物含量、成分等質(zhì)量控制[24]，建立完善的藥物溯源體系；金屬材料方面主要用于產(chǎn)品的化學成分及物理性能的分析；油品領域標準物質(zhì)用于石油產(chǎn)品量值傳遞、方法評價和質(zhì)量監(jiān)督；食品基體標準物質(zhì)數(shù)量相對較大，可用于評價并驗證食品安全及相關管理機制，對國內(nèi)食品安全風險進行評估，在國際貿(mào)易中提供檢測報告和數(shù)據(jù)支撐；環(huán)境相關基體標準主要用于應對大氣污染、水污染和土壤污染，在環(huán)境安全監(jiān)管中配合相關法律提供數(shù)據(jù)支持和相關量值。

2 食品中類固醇激素基體標準物質(zhì)的研究現(xiàn)狀

類固醇激素主要分為腎上腺受體激素和性激素兩類，在實際使用中多作為飼料添加劑使用，藥用價值相對較低，適用范圍較小，同時由于部分類固醇激素被禁止使用，因此目前以類固醇激素為目標物的食品基體標準物質(zhì)研制數(shù)量相對較少，主要為腎上腺皮質(zhì)激素類的β-激動受體劑和部分類性激素或與性激素具有相似作用的物質(zhì)，現(xiàn)行的有證基體標準物質(zhì)共有6種且均為β-受體激動劑類，類固醇基體標準物質(zhì)如表1所示。

表1 類固醇激素基體標準物質(zhì)

2.1 β-受體激動劑基體標準物質(zhì)

β-受體激動劑是一類化學合成的苯乙醇胺類物質(zhì)[25]，屬于類固醇激素中腎上腺皮質(zhì)激素的一種，俗稱瘦肉精。臨床上使用較多及可產(chǎn)生食物污染的藥物有萊克多巴胺(RAC)、鹽酸克倫特羅(CLB)、沙丁胺醇(SAL)、溴布特羅(BBT)、溴代克倫特羅(BCT)等[26]。β-受體激動劑添加進飼料被動物進食后在機體內(nèi)代謝速率慢，殘留量較高[27]，消費者食用后會引起急性中毒以及不同程度的病變和危害[28]。目前，有關β-激動受體劑的檢測方法包括免疫分析法[29]、液相色譜法[30]、液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法[31]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[32]等，但其精確度和回收率等均存在一定的不足，而有關β-受體激動劑的基體標準物質(zhì)數(shù)量相對較少，有證標準物質(zhì)共有6種，其中一級標準物質(zhì)4種，二級標準物質(zhì)2種[23]。

李蘭英等[33]研制了豬尿凍干粉中鹽酸克倫特羅標準物質(zhì)，建立了4種目標物濃度水平，采用液相色譜—串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS/MS)和酶聯(lián)免疫法對目標物進行檢測，均勻性和14 d內(nèi)短期穩(wěn)定性及12個月內(nèi)長期穩(wěn)定性良好，4個質(zhì)量濃度的定值結(jié)果分別為0.65，1.28，3.78，11.50 ng/mL，標準不確定度分別為0.072，0.220，0.230，0.860 ng/mL，擴展不確定度分別為0.15，0.44，0.46，1.80 ng/mL，該標準物質(zhì)的研制為中國滿足了豬尿中克倫特羅殘留實驗室質(zhì)量控制和方法驗證提供了依據(jù)，同時也有利于實現(xiàn)肉類制品在屠宰前排除食品安全風險的條件；郭德華等[34]研制了魚粉中克倫特羅、沙丁醇胺基體標準物質(zhì)，采用短期飼喂藥物的方式獲取陽性樣品，給藥期結(jié)束后采用凍干冷凍技術將魚肉制成粉狀樣品，采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法對基體標準物質(zhì)進行定值，均勻性、穩(wěn)定性良好，克倫特羅及沙丁醇胺的定值結(jié)果分別為9.9，12.8 μg/kg，該標準物質(zhì)采用鯽魚作為基質(zhì)，條件控制和飼養(yǎng)簡單，大大降低了動物個體差異產(chǎn)生的影響，填補了水產(chǎn)品中β-受體激動劑基體標準物質(zhì)的空白，后期檢測結(jié)果表明該標準物質(zhì)可以滿足相關檢測機構(gòu)、實驗室等對β-受體激動劑質(zhì)量控制的要求。

2.2 雄激素基體標準物質(zhì)

雄激素屬于類固醇激素中性激素的一種，主要由動物睪丸合成，腎上腺及卵巢也會少量產(chǎn)生。在動物養(yǎng)殖過程中，雄激素的使用對動物機體的影響是全身性的，可以促進肌肉合成，通過經(jīng)典的基因途徑和非基因途徑來促進骨骼肌肥大[35]，縮短多種食用性動物的成熟時間和育肥期，大幅提高利潤轉(zhuǎn)化率。國內(nèi)外學者報道的關于雄激素引發(fā)的食品安全問題的檢測方法研究相對較多，但檢測指標和檢測標準并未得到統(tǒng)一[36]，相關基體標準物質(zhì)資源較為缺乏。

肖月婷等[37]建立了一種奶粉中類固醇激素基質(zhì)標準物質(zhì)同位素稀釋質(zhì)譜定值方法，使用牛奶作為原料，添加睪酮和甲睪酮混合標準溶液后通過濕法噴霧技術制成粉狀物質(zhì)，充分混勻后采用同位素稀釋質(zhì)譜法(IDMS)對目標物質(zhì)進行檢測并結(jié)合樣品稀釋法減小基質(zhì)效應，回收率與精密度符合國標定值方法，均勻性及短期穩(wěn)定性檢驗結(jié)果良好，通過不確定度評定后，睪酮和甲睪酮的量值分別為(19.4±1.4)μg/kg(k=2)，(21.0±1.4)μg/kg，該方法的建立填補了中國雄激素基體標準物質(zhì)定值方法的空白，同時也為相關基體標準物質(zhì)的研制、實驗室能力驗證及食品中雄激素殘留檢測提供了較為重要的參考意義。

2.3 雌激素基體標準物質(zhì)

雌激素為另一類性激素，屬于強內(nèi)分泌干擾物，對生物機體內(nèi)分泌具有一定的破壞性。天然雌激素主要由哺乳動物卵巢合成，代表物質(zhì)有雌酮、雌二醇等，人工合成雌激素藥物有炔雌醇、苯甲酸雌二醇等[38]。雌激素與其他大部分激素具有相同的促進動物生長、調(diào)節(jié)動物發(fā)情周期、提高繁殖效率等作用，常被作為飼料添加劑使用。由于穩(wěn)定性較高，在動物體內(nèi)不易被降解，人食用后會在體內(nèi)積累，對生殖系統(tǒng)、生長發(fā)育甚至行為方面產(chǎn)生較為嚴重的影響[39]。除了直接污染動物性食品外，養(yǎng)殖過程中由于廢水及糞便處理不當導致環(huán)境中雌激素殘留的問題也屢見報道[40]。同時，產(chǎn)乳動物自身體內(nèi)代謝的雌激素也存在殘留在食物及相關乳制品中的風險[41]，而長期食用被雌激素污染的乳及乳制品會一定程度增加患乳腺癌的風險[42-43]。李杰等[44]研制了動物性食品中雌激素類獸藥殘留檢測用同位素標記標準物質(zhì)，選用玉米赤霉烯醇和玉米赤霉烯酮作為雌激素目標物，均勻性、穩(wěn)定性良好，采用同位素稀釋內(nèi)標法對標準物質(zhì)進行檢測和定值，標準物質(zhì)特征值為99.3～100.3 μg/mL，該標準物質(zhì)通過多項考察可以滿足中國食品殘留檢測要求，具有一定的市場潛力；牛欣寧[45]研制了玉米粉中玉米赤霉烯酮ZEA基體標準物質(zhì)，原料使用玉米顆?？瞻讟悠罚褂孟鄳獫舛鹊臉藴嗜芤航?4 h后通過冷凍干燥技術凍干，研磨成粉狀，充分混勻制成基體標準物質(zhì)。ZEA基體標準物質(zhì)使用高效液相色譜法檢測目標物質(zhì)，采用鋁箔袋真空包裝，均勻性、14 d內(nèi)44 ℃環(huán)境下短期穩(wěn)定性以及12個月分別于4，-18 ℃下長期穩(wěn)定性檢驗符合標準物質(zhì)研制要求，通過多家實驗室對該玉米粉玉米赤霉烯酮標準物質(zhì)聯(lián)合定值及不確定度評定后，結(jié)果為(137±26)μg/kg，該標準物質(zhì)的研制豐富了中國類雌激素基體標準物質(zhì)的種類，填補了中國農(nóng)產(chǎn)品中雌激素污染基體標準物質(zhì)的空白，為相關研究在后期研制、定值等提供了一定參考。

3 展望

固醇類激素基體標準物質(zhì)研究的主要問題包括涉及基質(zhì)數(shù)量少、目標物種類少以及特征值單一等。牛羊產(chǎn)品、禽蛋等在中國消費和進出口數(shù)量龐大，相關的固醇類激素基體標準物質(zhì)尚處于空白；同時，類固醇激素的使用雖然已經(jīng)受到嚴格限制，但相關藥物種類豐富，在食源性動物治療過程中使用廣泛，其可能導致的食品安全風險依舊存在；此外，目前已研制的基體標準物質(zhì)多為單一特性值，無法完全滿足食品中類固醇激素的檢測需求。因此，推動固醇類激素基體標準物質(zhì)的研制開發(fā)不僅可以有效提升國內(nèi)的食品安全保障水平，面對不斷提升的國外食品安全標準也具有重要意義。

中國的基體標準物質(zhì)種類和數(shù)量近年來雖處于上升階段，但多為復制產(chǎn)品，自主研發(fā)能力和國外相比依舊存在一定差距。為有效提升基體標準物質(zhì)的研制水平和應用價值，加大宣傳力度，通過國內(nèi)外技術交流、培訓等方式使人們熟知基體標準物質(zhì)的作用，制定統(tǒng)一標準，使研制規(guī)范化，通過權威機構(gòu)帶動具有研發(fā)能力的企業(yè)，對其進一步推廣，以擴大其應用范圍，從而使食品安全質(zhì)控體系得到提升。