檳榔蒂水提物對3種食用菌菌絲體品質及抗氧化活性的影響

包怡紅 賴章飛 馬銀鵬 賈雨彤 潘飛兵 匡鳳嬌

(1.東北林業大學林學院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150040；3.海南華創檳榔研究院，海南 海口 570100；4.海南口味王科技發展有限公司，海南 萬寧 571501)

平菇、榆黃蘑、金針菇是消費者比較認可的食用菌，在中國栽培歷史悠久[1-2]，是公認的健康食品[3]。食用菌制種主要有固體培養和液體發酵兩種，其中液體發酵具有生長周期短、菌絲活力旺盛等優點[4-5]，是獲得大量菌絲體和活性物質的常用方法[6]。

目前，利用中藥殘渣或林業廢棄資源提取物進行液體發酵以改善食藥用真菌的品質，成為該領域研究熱點[7]。研究發現在發酵體系中添加外源物質如天麻提取物[8]、玉米油[9]等，能促進食藥用菌的菌絲生長和多糖等代謝產物的產量。周麗思等[10]在培養基中添加不同濃度的忍冬莖水提物，研究其對茶藨子葉狀層菌發酵菌絲體生長和代謝產物的影響，結果表明忍冬莖水提物可顯著提高菌絲體中麥角甾醇、總多糖等成分的含量。潘琴等[11]研究了麻櫟木醋液(主要成分為有機酸類、醛類、酮類、酚類等)對8種食用菌菌絲體生長的影響，發現適宜濃度的麻櫟木醋液對食用菌菌絲體生長有明顯的促進作用，而濃度過高時則抑制其生長。

檳榔(ArecacatechuL.)是棕櫚科植物檳榔的成熟果實，主產于中國海南、臺灣、云南，在廣西、廣東、湖南及福建等省也有少量分布[12]。檳榔含有多種氨基酸、礦物質、粗纖維、生物堿和酚類物質，具有很高藥用和經濟價值[13-14]。作為中國著名四大南藥(檳榔、益智、砂仁、巴戟)之首，檳榔具有抗炎、抗抑郁、抑菌等作用，同時由于酚類化合物的存在而具有較高的抗氧化性能[15-16]。檳榔蒂是檳榔果實加工后的副產物，現多數企業直接廢棄，不但造成資源浪費，更因腐爛霉變造成環境污染。研究通過在平菇、榆黃蘑、金針菇液體發酵培養基中添加不同濃度檳榔蒂水提物，探討發酵過程中這3種食用菌菌絲體品質、抗氧化活性以及關鍵酶活性等指標的變化，旨在研究檳榔蒂水提物對3種食用菌菌絲體生長的影響，為進一步開發新的食用菌栽培基質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

平菇、榆黃蘑、金針菇菌種：黑龍江省科學院微生物研究所；

檳榔蒂：海南華創檳榔研究中心；

蘆丁、沒食子酸、齊墩果酸、3，5-二硝基水楊酸、硝酸鋁、硝酸鈉、氫氧化鈉、福林酚、碳酸鈉、苯酚、H2SO4、無水乙醇、葡萄糖、瓊脂粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂：分析純，上海源葉生物科技公司；

試驗用水：蒸餾水，市售；

馬鈴薯：市售。

1.1.2 主要儀器設備

電子分析天平：YP2002型，上海佑科儀器儀表有限公司；

酶標儀：RT-6000型，上海一恒科學儀器有限公司；

電熱恒溫水浴鍋：DK-98-ⅡA型，天津市泰斯特儀器有限公司；

振蕩培養箱：HZQ-X100型，哈爾濱市東明醫療儀器廠；

立式壓力蒸汽滅菌器鍋：DY04-13-44-00型，上海東亞壓力容器制造有限公司；

離心機：TD5A型，湖南凱達科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檳榔蒂水提物制備

(1)檳榔蒂原料預處理：將檳榔蒂中雜質挑除，曬干后粉碎過60目篩，干燥器中存放備用。

(2)水提物制備：準確稱取檳榔蒂粉末20 g，按料液比1∶20(g/mL)加水浸泡1 h后，在超聲功率300 W、溫度100 ℃條件下提取30 min，10 000 r/min離心10 min取上清液，提取2次合并上清液，將上清液濃縮至100 mL以下，真空冷凍干燥(壓力20 Pa，冷阱溫度-40 ℃，時間24 h)得到檳榔蒂水提物干粉，備用。

1.2.2 檳榔蒂水提物主要成分測定

(1)溶液配制：取2.5 g檳榔蒂水提物干粉，用蒸餾水溶解定容至25 mL，得質量濃度為0.1 g/mL的水提物待測樣液。

(2)多糖含量測定：采用苯酚—硫酸法[17]。

(3)多酚含量測定：采用Folin-酚法[18]。

(4)黃酮含量測定：采用NaNO2-Al(NO3)3比色法[19]。

(5)檳榔堿含量測定：參照劉文杰[20]的方法。

1.2.3 培養基制作

(1)PDA培養基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊放入燒杯中，加水1 000 mL煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液補充水分到1 000 mL，加入20 g葡萄糖、20 g瓊脂、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O，加熱溶解，分裝于試管，121 ℃滅菌30 min。

(2)液體培養基：去皮馬鈴薯200 g，切成小塊放入燒杯中，加水1 000 mL煮沸30 min，用4層紗布過濾，濾液補充水分到1 000 mL，加入20 g葡萄糖、1 g KH2PO4、0.5 g MgSO4·7H2O，加熱溶解，分裝于250 mL三角瓶中，裝液量100 mL，121 ℃滅菌30 min。

1.2.4 菌種制備

(1)斜面菌種活化：用接種鏟取菌塊(d=4 mm)接入PDA培養基中27 ℃恒溫培養7 d，備用。

(2)液體菌種制備：已活化的斜面菌絲體，接種到裝有100 mL液體培養基的250 mL三角瓶中，27 ℃恒溫振蕩培養7 d得液體菌種。

1.2.5 菌絲體長速測定 參照盧朝亮等[21]的方法，檳榔蒂水提物添加量分別為1.6，3.2，4.8，6.4，8.0 mg/mL，制作PDA試管斜面培養基，以未添加檳榔蒂水提物的培養基為對照，取菌塊(d=4 mm)接入培養基中，于培養箱中27 ℃恒溫培養。待菌種萌發，每日在菌絲前端對應位置的試管壁上劃線，測其長速，求10 d長速平均值。

1.2.6 發酵培養 取250 mL三角瓶，配制液體培養基，檳榔蒂水提添加量分別為1.6，3.2，4.8，6.4，8.0 mg/mL，以不加檳榔蒂水提物為空白對照，按接種量5%將液體菌種接種到發酵培養基中，在溫度27 ℃，轉速150 r/min的恒溫振蕩培養箱中培養7 d。

1.2.7 菌絲體生物量測定 采用干重法測定。發酵液以4 000 r/min離心5 min得菌絲球，用無菌水反復漂洗，于60 ℃烘干至恒重后用分析天平稱菌絲體干質量，菌絲體粉碎過60目篩，備用。

1.2.8 菌絲體提取物制備及相關指標測定

(1)水提液：稱取菌絲體粉末0.4 g，按料液比1∶35(g/mL)加入蒸餾水，超聲功率300 W、70 ℃下提取2 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液定容至20 mL得菌絲體水提液，4 ℃下保存備用。

(2)醇提液：稱取菌絲體粉末0.4 g，按料液比1∶35(g/mL)加入70%的乙醇溶液，超聲功率300 W、70 ℃下提取2 h，5 000 r/min離心10 min，收集上清液定容至20 mL得菌絲體醇提液，4 ℃下保存備用。

(3)胞內多糖測定：精確稱取菌絲體粉末1 g，與蒸餾水以料液比1∶10(g/mL)混合，90 ℃下熱水浸提2 h，4 000 r/min離心15 min取上清液，加入3倍體積99.7%的乙醇，4 ℃沉淀24 h，4 000 r/min離心15 min，沉淀用95%乙醇洗滌，然后用蒸餾水復溶，定容至50 mL備用。胞內多糖測定方法同1.2.2(2)。

(4)菌絲體多酚和黃酮含量測定：分別取1 mL菌絲體乙醇提取液，測定多酚和黃酮含量，測定方法同1.2.2(3)和1.2.2(4)。

(5)三萜含量測定：采用香草醛—冰醋酸法[22]。

1.2.9 抗氧化活性測定

(1)DPPH自由基清除率：參照范俐等[23]的方法略做修改，用無水乙醇配制0.2 mmol/L的DPPH溶液，于試管中依次加入1 mL DPPH溶液、2 mL蒸餾水以及1 mL 菌絲體水提液和醇提液，混勻，于25 ℃水浴鍋中避光反應20 min，517 nm下測定吸光值。按式(1)計算DPPH自由基清除率。

Q1=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

(1)

式中：

Q1——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品吸光值；

A2——未添加DPPH溶液的樣品吸光值；

A0——空白吸光值。

(2)還原力：采用鐵氰化鉀顯色法[24]。10 mL離心管中分別加入菌絲體水提物和醇提物0.5 mL，加入2.5 mL 磷酸鹽緩沖液(0.2 mol/L，pH 6.6)和1%的鐵氰化鉀溶液1 mL，混勻，于50 ℃水浴鍋反應30 min，反應完快速冷卻，加入10%的三氯乙酸2.5 mL，混勻，3 000 r/min離心10 min，取2.5 mL上清液，加入2.5 mL蒸餾水和0.1%的三氯化鐵溶液0.5 mL，混勻靜置10 min，于700 nm下測定吸光值。按式(2)計算菌絲體的還原力。

H=A1-A2，

(2)

式中：

H——還原力；

A1——樣品吸光值；

A2——空白吸光值。

(3)ABTS自由基清除率：取5 mL 7 mmol/L的ABTS溶液，加入到100 μL過硫酸鉀溶液中，混勻，于25 ℃ 下避光反應12 h，用pH 7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋ABTS自由基溶液使其在734 nm下的吸光值為0.7，取1 mL菌絲體水提液和醇提液，加入2 mL ABTS溶液混勻，于25 ℃水浴鍋中避光反應20 min，734 nm下測定吸光值。按式(3)計算ABTS自由基清除率。

Q2=[1-(A1-A2)/A0]×100%，

(3)

式中：

Q2——ABTS自由基清除率，%；

A1——樣品吸光值；

A2——未添加ABTS溶液的樣品吸光值；

A0——空白吸光值。

1.2.10 胞外酶活性測定

(1)粗酶液制備：液體發酵培養接種后每隔24 h吸取發酵液5 mL，4 000 r/min離心5 min，取上清液即為粗酶液，連續測定7 d。

(2)淀粉酶活性測定：參照徐秀紅等[25]的方法，根據葡萄糖標準曲線計算還原糖含量，以在沸水浴中滅活的酶液為對照。酶活力定義：1 mL發酵液中酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為一個活力單位。

(3)纖維素酶活性測定：用pH 4.6、0.1 mol/L的醋酸鹽緩沖液配制0.5%的CMC-Na溶液，取25 mL試管，加入1.5 mL CMC-Na溶液和0.5 mL粗酶液，混勻后，于45 ℃恒溫水浴中反應30 min，其后操作同淀粉酶活性測定，于520 nm處測定吸光值，根據葡萄糖標準曲線計算還原糖含量，以在沸水浴中滅活的酶液為對照。酶活力定義：1 mL發酵液中酶量與底物作用30 min釋放出1 mg 葡萄糖為一個活力單位。

(4)木聚糖酶活性測定：用pH 4.6、0.1 mol/L的醋酸鹽緩沖液配制0.5%的木聚糖溶液，取25 mL試管，加入1.5 mL木聚糖溶液和0.5 mL粗酶液，混勻后，于50 ℃ 恒溫水浴中反應30 min，其后操作同淀粉酶活性測定，于520 nm處測定吸光值，根據木糖標準曲線計算還原糖含量，以在沸水浴中滅活的酶液為對照。酶活力定義：1 mL發酵液中酶量與底物作用30 min釋放出1 mg木糖為一個活力單位。

(5)漆酶活性測定：參照Li等[26]的方法略做修改，配制0.5 mmol/L的ABTS溶液，酶活反應體系包含ABTS溶液0.5 mL、0.1 mol/L的醋酸鹽緩沖液(pH 4.6)1 mL，加入酶液0.5 mL啟動反應，在反應的前5 min內每隔30 s記錄一次OD420 nm值變化，以在沸水浴中滅活的酶液為對照。酶活力定義：1 mL發酵液中酶量與底物(ABTS)作用每分鐘使OD420 nm值改變0.01為一個活力單位。

1.2.11 數據處理 每組試驗重復3次，采用Excel對原始數據進行統計，數據分析和作圖分別采用IBM SPSS Statistics 22.0和Origin 2021。

2 結果與分析

2.1 檳榔蒂水提物主要成分

檳榔蒂經粉碎提取后得到水提物，主要成分含量測定結果見表1。水提物中豐富的活性成分可促進真菌菌絲體分泌胞外酶，還可能通過增加真菌細胞壁的通透性，從而有利于營養物質的攝取和活性物質的生物合成積累[27]。

表1 檳榔蒂水提物主要成分

2.2 檳榔蒂水提物對菌絲長速的影響

由表2可知，隨著檳榔蒂水提物添加量的增加，3種菌種的菌絲長速先呈上升趨勢，與對照組相比較，平菇、榆黃蘑的菌絲長速有顯著提高，金針菇菌絲長速差異不顯著，檳榔蒂水提物添加量為6.4，4.8，3.2 mg/mL時，平菇、榆黃蘑、金針菇的菌絲長速分別達到最高，之后呈下降趨勢，但均高于對照組。這表明3種菌種均可在添加檳榔蒂水提物的培養基中生長，且根據試驗觀察，檳榔蒂水提物可有效縮短3種菌種的菌絲萌發時間。

表2 檳榔蒂水提物添加量對菌絲長速的影響?

2.3 檳榔蒂水提物對菌絲體生物量的影響

由表3可知，與對照組相比，檳榔蒂水提物對3種菌種生物量的影響均表現為先上升趨勢，檳榔蒂水提物添加量為6.4 mg/mL時，平菇菌絲生物量達到最高值，與對照組相比提高了46.25%，添加量為4.8 mg/mL時，榆黃蘑、金針菇生物量達到最高值，與對照組相比分別提高了14.77%，26.83%，之后生物量開始下降，但仍高于對照組，原因可能是添加少量的檳榔蒂水提物時，其中的糖類、酚類等活性物質對菌絲生長有一定促進作用，而過高的添加量會造成液體培養基黏度增加和溶氧量降低，不利于菌絲體生長[28]。此外，還考慮到檳榔蒂水提物中殘留的微小顆粒會富集在菌絲表面，對菌絲生長也有一定抑制作用。

表3 檳榔蒂水提物添加量對菌絲體生物量的影響?

2.4 檳榔蒂水提物對菌絲體多糖、三萜含量的影響

由圖1可知，隨著培養基中檳榔蒂水提物添加量逐漸增高，菌絲體多糖和三萜含量呈先升后降趨勢，檳榔蒂水提物添加量為6.4 mg/mL時，平菇菌絲體多糖達到最高值，與對照組相比提高了27.40%，添加量為4.8 mg/mL時，榆黃蘑、金針菇胞內多糖與對照組相比分別提高了22.20%，8.71%；菌絲體三萜含量均在檳榔蒂水提物添加量為4.8 mg/mL時最高，與對照組分別提高了95.24%，70.91%，75.00%；說明檳榔蒂水提物的添加對3種食用菌菌絲體多糖和三萜的合成有促進作用，并且與生物量的變化趨勢一致；這是由于菌絲體在快速生長時期，細胞代謝旺盛，相關酶系活躍，生物量增加的同時，活性物質的合成速率加快，含量也隨之增加，與趙小瑞等[29]以當歸、黨參、甘草、黃芪提取物作為激發因子，研究靈芝液態發酵過程中菌絲生長和產三萜的研究結果相似。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.5 檳榔蒂水提物對菌絲體多酚、黃酮含量的影響

由圖2可知，隨著培養基中檳榔蒂水提物添加量的逐漸增高，多酚和黃酮含量呈先升后降趨勢，檳榔蒂水提物添加量為6.4 mg/mL時，平菇菌絲體多酚和黃酮達到最高值，與對照組相比分別提高了72.99%，34.48%，添加量為4.8 mg/mL時，榆黃蘑、金針菇菌絲體多酚與對照組相比提高了33.74%，46.37%，黃酮與對照組相比分別提高了53.30%，37.04%。檳榔蒂水提物中含有豐富的水溶性酚類物質，添加不同量的檳榔蒂水提物作為菌絲生長外源代謝前體，有利于菌絲體對酚類物質的代謝和轉化，與吳俐等[30]考察的油茶枝浸提液對茶薪菇菌絲酚類代謝影響的結果相似。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.6 抗氧化活性評價

2.6.1 DPPH自由基清除能力 由圖3可知，平菇、榆黃蘑、金針菇菌絲體的水提物和醇提物對DPPH自由基均有一定的清除作用，隨著培養基中檳榔蒂水提物添加量的逐漸增高，菌絲體水提物和醇提物對DPPH自由基的清除能力呈先升后降趨勢，檳榔蒂水提物添加量為6.4 mg/mL時，平菇菌絲體水提物和醇提物DPPH自由基清除率分別為55.76% 和65.33%，與對照組相比提高了24.77%和17.27%，檳榔蒂水提物添加量為4.8 mg/mL時，榆黃蘑、金針菇菌絲體清除DPPH能力達到最大；不同提取物對DPPH自由基的清除率大小差異顯著，依次為榆黃蘑醇提物>金針菇醇提物>平菇醇提物>榆黃蘑水提物>金針菇水提物>平菇水提物。

Pw.平菇菌絲體水提物 Yw.榆黃蘑菌絲體水提物 Jw.金針菇菌絲體水提物 Pe.平菇菌絲體醇提物 Ye.榆黃蘑菌絲體醇提物 Je.金針菇菌絲體醇提物

2.6.2 還原力 由圖4可知，平菇、榆黃蘑、金針菇菌絲體的水提物和醇提物對Fe3+具有不同程度的還原能力，隨著培養基中檳榔蒂水提物添加量的逐漸增高，菌絲體水提物和醇提物對Fe3+的還原能力呈先升后降趨勢，檳榔蒂水提物添加量為6.4 mg/mL時，平菇菌絲體水提物和醇提物對Fe3+的還原能力達到最大，添加量為4.8 mg/mL時，榆黃蘑、金針菇菌絲體對Fe3+的還原能力達到最大；各提取物對Fe3+的還原能力大小依次為榆黃蘑醇提物>金針菇醇提物>平菇醇提物>榆黃蘑水提物>金針菇水提物>平菇水提物。

Pw.平菇菌絲體水提物 Yw.榆黃蘑菌絲體水提物 Jw.金針菇菌絲體水提物 Pe.平菇菌絲體醇提物 Ye.榆黃蘑菌絲體醇提物 Je.金針菇菌絲體醇提物

2.6.3 ABTS自由基清除能力 由圖5可知，平菇、榆黃蘑、金針菇菌絲體的水提物和醇提物對ABTS自由基均有一定的清除作用，隨著培養基中檳榔蒂水提物添加量的逐漸增高，菌絲體水提物和醇提物對ABTS自由基的清除能力呈先升后降趨勢，檳榔蒂水提物添加量為6.4 mg/mL時，平菇菌絲體水提物和醇提物ABTS自由基清除率達到最大，與對照組相比提高了51.34%和39.74%，添加量為4.8 mg/mL 時，榆黃蘑、金針菇菌絲體清除ABTS自由基能力達到最大；不同提取物對ABTS自由基的清除率大小差異顯著，依次為榆黃蘑醇提物>榆黃蘑水提物>金針菇醇提物>平菇醇提物>平菇水提物>金針菇水提物。

Pw.平菇菌絲體水提物 Yw.榆黃蘑菌絲體水提物 Jw.金針菇菌絲體水提物 Pe.平菇菌絲體醇提物 Ye.榆黃蘑菌絲體醇提物 Je.金針菇菌絲體醇提物

2.7 檳榔蒂水提物對酶活性的影響

隨著液體發酵進程的推進，菌絲分泌胞外酶，培養基中的營養物質不斷被菌絲營養代謝轉化利用，促進菌絲生長。根據3種菌種菌絲生物量、活性成分含量以及抗氧化活性的結果，平菇選擇添加6.4 mg/mL的檳榔蒂水提物、榆黃蘑和金針菇選擇添加4.8 mg/mL的檳榔蒂水提物，分別測定3種菌種液態發酵過程中淀粉酶、纖維素酶、木聚糖酶和漆酶的活性變化。

2.7.1 淀粉酶活性變化 由圖6可知，3種菌種的淀粉酶活性變化規律基本一致，初始1～3 d時，淀粉酶活性升高，菌種顆粒周圍開始長出白色菌絲，在培養第3天酶活性達到最高，隨著培養基中營養物質慢慢被利用，酶活性開始下降，培養4～5 d時，菌絲長至一定時期斷落至菌液中形成新的萌發點，此時酶活又有所上升，達到另一個高點，隨著營養物質徹底被吸收利用，酶活性開始下降。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7.2 纖維素酶活性變化 由圖7可知，培養1～3 d時，3種菌種纖維素酶活性呈上升趨勢，第3天達到最高，之后酶活性開始下降，培養至第6天達到另一個高點，變化規律與淀粉酶基本一致；3種菌種相比，酶活性差異不顯著，金針菇的纖維素酶活性從第3天后一直呈下降趨勢，未出現第二個高點，可能與不同菌種自身特性有關。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7.3 木聚糖酶活性變化 由圖8可知，培養1～3 d時，3種菌種木聚糖酶活性呈上升趨勢，第3天達到最高，之后酶活性開始下降，培養至第6天達到另一個高點，變化規律與淀粉酶基本一致。3種菌種相比，酶活性差異不顯著，金針菇的纖維素酶活性從第3天后一直呈下降趨勢，未出現第二個高點。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

2.7.4 漆酶活性變化 由圖9可知，3種菌種漆酶初始活性偏低，隨著培養時間的增加，漆酶活性開始上升，第3天達到最大活性，之后漆酶活性開始下降，平菇和榆黃蘑在培養第6天漆酶活性再次上升，之后隨著培養的進行，開始呈下降趨勢，檳榔蒂水提物的添加只改變了3種菌種的酶活性大小，對酶活性變化趨勢影響不大。

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結論

在一定濃度范圍內，檳榔蒂水提物能促進平菇、榆黃蘑、金針菇菌絲體生長，添加過量的檳榔蒂水提物對菌絲體生長有抑制作用。在最適添加濃度下，3種菌絲體的多糖、三萜、多酚、黃酮含量與對照組相比有顯著提高(P<0.05)。隨著檳榔蒂水提物添加量的增加，3種菌絲體的水提物和醇提物抗氧化活性均有顯著提高(P<0.05)，其活性大小依次為榆黃蘑>金針菇>平菇；檳榔蒂水提物能在一定程度上提高3種食用菌生長代謝相關酶的活性，但對酶活性變化趨勢的影響不顯著。

檳榔蒂水提物添加到食用菌液體培養體系中，可以提高菌絲體的生物量、活性成分含量以及抗氧化能力，但檳榔蒂水提物促進菌絲體生長的具體成分尚不明確，還需進一步研究。