靈芝酸A分子印跡聚合物電化學傳感器的制備及應用

黃桂珍 汪慶祥 陳金美 詹峰萍 魏 嵐 鄭婉榕

(1.閩西職業技術學院，福建 龍巖 364021；2.閩南師范大學化學化工與環境學院，福建 漳州 363000)

靈芝是一種具有抗腫瘤、調節免疫、防艾滋病病毒、抗氧化、延緩衰老等多種作用的藥用真菌[1-3]，其藥理作用主要歸因于靈芝中含有的多種三萜類化學成分和多糖等。靈芝酸A(GAA)作為靈芝的主要活性成分之一，表現出顯著的抗腫瘤、護肝及抗癌作用[4]，GAA含量直接影響靈芝的藥用價值，因此建立一種簡單、快速的GAA分析方法對評價靈芝品質具有重要意義。

目前，GAA的檢測方法有分光光度法[5-7]、離子色譜法[8-9]、高效液相色譜法[10-12]等。但上述方法存在操作繁瑣、成本高昂及分析時間長等問題。相比之下，分子印跡聚合物(MIP)基傳感技術具有選擇性強、化學性質穩定、對環境的耐受性好和制備簡單、造價低廉等優點。與電化學技術相結合得到分子印跡電化學傳感器不僅操作簡單、成本低廉、選擇性較好，而且能獲得高的靈敏度[13-15]。MIP基電化學傳感器目前已被廣泛用于藥物分子[16]、環境污染物[17]、生物分子[18]的檢測。然而，截至目前，關于GAA的分子印跡電化學傳感器的研究尚未見報道。鄰苯二胺(OPD)易發生聚合反應，適用于一步電合成聚鄰苯二胺超薄膜，并且在不添加交聯劑和致孔劑的情況下即可與模板分子產生作用，是電化學傳感器中實現非共價分子印跡最常用的單體之一，且具有選擇性高和響應時間短的特點[19-21]。

研究擬以OPD作為功能單體，采用一步電化學聚合法在玻碳電極表面制備一層能特異性識別GAA的MIP膜，用于GAA的快速、靈敏檢測，為靈芝粉浸出液中GAA檢測及靈芝粉品質評價提供新的技術支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OPD和GAA：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

木犀草素：分析純，上海麥克林生化科技有限公司；

綠原酸、鹽酸多巴胺、冰醋酸和醋酸鈉：分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司；

試驗用水均為去離子水。

1.2 儀器與設備

掃描電子顯微鏡(SEM)：S-4800型，日本Hitachi公司；

電化學工作站：CHI-650D型，上海辰華儀器有限公司；

超聲波清洗器：KQ52200E型，上海超聲儀器有限公司；

電子天平：AL224CN型，奧豪斯儀器有限公司；

恒溫培養搖床：20140639型，上海蘇坤實業有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀(FTIR)：NICOLETiS10型，美國賽默飛世爾科技公司；

三電極系統：玻碳電極(GCE，直徑3 mm)為工作電極，Ag/AgCl為參比電極，鉑柱電極為對電極，上海辰華儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 前驅溶液的制備 稱取1.0 mg(0.2 mmol)GAA和1.3 mg(1.2 mmol)OPD，加入到2 mL HAc-NaAc(pH 5.2)緩沖液中，配制成含有0.1 mmol/L GAA和0.6 mmol/L OPD的混合溶液。攪拌2 min后得到均勻溶液后，將混合溶液超聲反應1 h，隨后通入氮氣10 min以除去溶液中的氧氣，得到MIP電聚合制備前驅液，密封備用。上述過程中不加入GAA模板分子，得到非印跡聚合物(NIP)制備前驅液，用于對照試驗。

1.3.2 MIP/GCE的電化學制備 首先，將玻碳電極(GCE)依次在0.05 μm和0.3 μm Al2O3粉漿中打磨，再用去離子水沖洗電極表面吸附的Al2O3顆粒，隨后置于超純水中超聲5 min除去電極表面雜質，通氮氣吹干，得到干凈的基底GCE。將GCE置于MIP前驅液中，采用循環伏安法(CV)在0～0.8 V電位范圍內掃描30圈。隨后，將其轉移到0.1 mol/L NaOH中，在-1～1 V電位窗口條件下掃描50圈，將電極上的模板分子、未聚合的物質以及其他雜質洗脫出來，最后用超純水沖去MIP電極表面的NaOH以及剩余雜質，即制得MIP/GCE，烘干備用。相似地，將不含GAA的NIP前驅液替換MIP前驅液，采用相同電聚合和洗滌步驟制備NIP修飾電極(NIP/GCE)。

1.3.3 GAA在MIP/GCE的吸附和電化學測試 將MIP/GCE浸入不同濃度的GAA溶液中，在77 r/min轉速下吸附50 min，隨后用去離子水淋洗，去除電極表面非特異性吸附的GAA分子，從而得到GAA吸附電極(GAA/MIP/GCE)。將GAA/MIP/GCE置于0.1 mmol/L 的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行循環伏安掃描(CV)和電化學阻抗法(EIS)表征。CV掃描范圍-0.2～0.6 V，掃描速率100 mV/s。EIS頻率范圍0.1 Hz～100 kHz，振幅5 mV。同樣以[Fe(CN)6]3-/4-為指示探針，采用微分脈沖伏安法(DPV)進行定量分析，DPV參數：電位區間-0.1～0.5 V、脈沖幅度0.05 V、脈沖寬度0.05 V。采用同樣方法考察NIP/GCE對GAA的識別性能?；贠PD聚合膜的GAA分子印跡電化學傳感器構建如圖1所示的示意圖。

圖1 GAA分子印跡電化學傳感器構建示意圖

1.3.4 試驗條件優化 為達到傳感器對GAA最佳的分析性能，從OPD電化學聚合掃描圈數、模板分子GAA洗脫圈數和GAA吸附時間進行試驗條件優化。具體方法：將GCE置于OPD和GAA混合溶液中進行電化學聚合，直至所得的CV曲線趨于穩定，考察OPD在GCE表面聚合是否達到飽和；將聚合后的電極在0.1 mol/L NaOH空白液中進行不同圈數CV掃描用于GAA洗脫，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行電化學檢測，當[Fe(CN)6]3-/4-峰電流達到最大穩定值，驗證GAA已洗脫完全；進一步將洗脫后的電極在GAA溶液中吸附不同時間，考察其在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中的電化學響應，當信號降到最低，驗證GAA與MIP吸附達到平衡。

2 結果與分析

2.1 電聚合過程

圖2(a)為GCE在含NIP前驅液中連續電聚合30圈的CV圖。聚合第一圈時，0.48 V處出現一個不可逆的氧化峰，對應于OPD上的氨基被氧化成帶正電荷的自由基的不可逆過程[22-23]。隨著掃描圈數的增加，該氧化峰強度逐漸下降，說明有不導電產物吸附在GCE表面，抑制了后續聚合吸附過程。當聚合至30圈時，該氧化峰趨于消失，表明GCE表面已完全被OPD聚合膜覆蓋。而當電解液為MIP前驅液時[圖2(b)]，同樣觀察到0.48 V附近有一不可逆氧化峰，證實了該峰來自于OPD的氧化。隨著掃描圈數的增加，該峰逐漸降低，說明不導電聚合產物吸附在電極表面。該結果也表明GAA的存在不會影響OPD的電化學聚合過程。值得注意的是，在相同的電聚合掃描圈數下，NIP前驅液的峰信號強度均低于MIP的峰信號強度。這可能是因為在電聚合成膜的過程中，由于MIP前驅液中的GAA與OPD通過氫鍵作用摻入聚合膜中，降低了OPD聚合膜的致密度，從而有利于后續的OPD在電極表面的擴散和氧化。

圖2 GCE在NIP和MIP前驅液中連續掃描的CV曲線

2.2 MIP物化表征

2.2.1 SEM表征 由圖3可知，經電化學聚合的NIP和MIP在電極表面均呈無規則顆粒狀材料，且覆蓋了整個電極表面。NIP表面光滑，而MIP材料表面具有大量孔洞。該差異表明，印跡模板分子GAA可有效從MIP中洗脫出來，并在MIP膜上留下與GAA分子匹配的“孔穴”。

圖3 NIP和MIP的SEM圖

2.2.2 FT-IR表征 采用FT-IR對NIP和MIP的化學結構進行表征，結果(如圖4所示)顯示NIP和MIP的特征吸收帶完全一致，表明二者的化學結構相同。在3 430 cm-1附近的寬吸收帶和1 650 cm-1處的吸收峰歸屬于N—H收縮振動和彎曲振動[24]。2 947 cm-1和2 882 cm-1歸屬于飽和的C—H振動吸收峰[25]。1 430 cm-1的吸收峰歸因于苯環上C═C骨架的伸縮振動[26]。1 043 cm-1處的吸收峰對應于聚合物中的C—N收縮振動。851 cm-1處的吸收峰表明存在吩嗪結構。上述結果證實電化學合成的MIP為在吩嗪的主鏈上具有苯環和喹環結構頭尾相連的聚合物。

圖4 NIP和MIP的FT-IR圖

2.3 不同修飾電極的電化學表征

使用CV法和EIS法，在0.1 mmol/L的[Fe(CN)6]3-/4-溶液中對不同修飾電極進行電化學表征，結果如圖5所示。由圖5(a)可以看出，[Fe(CN)6]3-/4-在裸GCE上有一對可逆的氧化還原峰(曲線a)，表明[Fe(CN)6]3-/4-在裸GCE表面發生很好的電子轉移過程。而[Fe(CN)6]3-/4-在電聚合后的GAA/MIP復合修飾電極上的氧化還原峰完全消失(曲線b)，是因為電極上覆蓋了一層致密且不導電的絕緣聚合膜，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-與基底電極的接觸。當去除GAA模板分子后，[Fe(CN)6]3-/4-在電極上又重新出現一對明顯的氧化還原峰(曲線c)，表明GAA分子可以有效地從MIP膜中洗脫，并留下空腔，成為[Fe(CN)6]3-/4-擴散到GCE表面的通道。對OPD-MIP重新吸附GAA的電極，發現[Fe(CN)6]3-/4-的氧化還原信號相比吸附前有明顯減弱(曲線d)。該試驗表明，GAA洗脫后的空腔構象與GAA功能基團相匹配，可用于GAA的吸附識別，重新占據MIP膜上空腔位點，導致[Fe(CN)6]3-/4-的CV信號減弱。

由圖5(b)可知，裸GCE上只有很小的電荷轉電阻(Rct)(曲線a)，表明GCE具有很好的導電能力。聚合后的GAA/MIP修飾電極Rct值最大(曲線b)，電極表面覆蓋了一層致密不導電的聚合物。在洗脫后的MIP/GCE上Rct值降低(曲線c)，是因為GAA模板分子被去除形成空腔，導電性增強。當在GAA溶液中重新結合后，形成復合物，阻礙了[Fe(CN)6]3-/4-靠近電極表面，所對應的Rct值有所升高(曲線d)，說明MIP電極對GAA具有識別能力。

a.裸GCE b.GAA/MIP/GCE c.MIP/GCE d.沖洗吸附后的GAA/MIP/GCE

2.4 模板洗脫圈數和GAA吸附時間優化

2.4.1 洗脫掃描圈數優化 在0.1 mol/L NaOH中進行GAA洗脫的CV掃描圈數直接影響傳感器MIP膜的空腔數量，洗脫圈數太少會導致大量GAA模板分子殘留在膜內，降低傳感器對GAA檢測的識別能力。由圖6可知，洗脫圈數為10～50圈時，峰電流值隨洗脫圈數的增加而增加，說明印跡孔穴逐漸增多。當洗脫圈數達到50圈后，峰電流值達到最大值，之后峰電流值不再有明顯的變化，說明GAA模板分子已從MIP膜中洗脫干凈。因此，選擇50圈為最優的CV洗脫圈數。

圖6 峰電流與CV掃描洗脫圈數關系曲線圖

2.4.2 GAA吸附時間優化 將GAA洗脫完全的傳感器浸入0.1 μmol/L GAA溶液不同時間，然后取出，在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行掃描，考察不同吸附時間對傳感器峰電流的影響。由圖7可知，峰電流值隨吸附時間的增加而減小，當吸附時間增加到50 min時電流峰值基本趨于穩定，說明GAA在MIP膜上的吸附達到平衡，因此50 min為傳感器吸附GAA的最佳時間。

圖7 峰電流與GAA吸附時間的關系曲線

2.5 分析性能

在最佳條件下，將MIP/GCE浸入不同濃度(1.0 pmol/L～1.0 μmol/L)的GAA溶液中吸附50 min，再在[Fe(CN)6]3-/4-溶液中進行DPV掃描，考察分子印跡傳感器對GAA的分析性能。由圖8(a)可知，隨著GAA濃度的增加，使所測的峰電流值逐漸降低，表明越來越多的GAA目標分子占據了MIP/GCE上空腔位點。峰電流值(Ip)與GAA濃度負對數(-lgC)在1.0 pmol/L～1.0 μmol/L范圍內呈良好的線性關系[圖8(b)]，其線性回歸方程為：Ip=18.2-0.710lgC，相關系數R2=0.995 1，檢出限為0.21 pmol/L。

圖8 MIP/GCE與不同濃度GAA吸附后的DPV曲線及其峰電流與GAA濃度負對數線性關系

2.6 重現性、穩定性和選擇性

平行制備5支MIP/GCE，在相同條件下對1.0 μmol/L GAA目標分子進行檢測，結果如圖9(a)所示。根據信號變化，求得相對標準偏差(RSD)為3.3%，表明所制備的傳感器具有良好的重現性。

圖9 MIP電化學傳感器的重復性和穩定性

將制備的MIP/GCE置于4 ℃冰箱中保存，每隔24 h使用DPV法對其進行連續檢測，并在第7天考察其對1.0 μmol/L GAA溶液的分析性能。結果如圖9(b)所示，MIP/GCE連續6 d的DPV峰電流變化很小；且第7天仍能用于GAA檢測，說明MIP/GCE具有良好的穩定性。

圖10為分子印跡傳感器在不同溶液(濃度均為1.0 μmol/L)中浸泡50 min后，在[Fe(CN)6]3-/4-中的DPV曲線。由圖10可知，MIP/GCE在空白液中的信號(曲線a)與其在綠原酸(曲線b)、木犀草素(曲線c)、多巴胺(曲線d)溶液中浸泡后的信號接近，表明傳感器對上述溶液不產生響應。而在GAA溶液中浸泡后，信號降低，且與在混合溶液中浸泡后的DPV峰電流值無明顯差異，表明該電化學傳感器對GAA有良好的選擇識別性。

a.空白液 b.綠原酸 c.木犀草素 d.多巴胺 e.GAA溶液 f.GAA、綠原酸、木犀草素和多巴胺混合溶液

2.7 實際樣品的檢測

將市場購買的靈芝粉實際樣品用水或乙醇作為溶劑分別配制10 mg/mL的靈芝液，靜置24 h。離心，取100 μL 靈芝液，用MIP/GCE進行浸泡吸附，后在[Fe(CN)6]3-/4-中進行檢測，根據峰電流值代入線性回歸方程計算分析得到相應的GAA的濃度。隨后在浸出靈芝液中分別加入不同濃度的標準GAA溶液進行回收率測定，結果如表1所示。結果顯示以乙醇為溶劑的浸出濃度為1.15 nmol/L，而以水為溶劑的浸出濃度僅為3.00 pmol/L，表明乙醇能更有效地使GAA從實際樣品中溶解出來。在兩種溶劑浸出液中進行標準加入法，得到的回收率分別為99%～102%和98%～101%，說明該方法所制備的分子印跡電化學傳感器對GAA的檢測具有較高的準確度，可用于靈芝粉等實際樣品的檢測。建立靈芝活性成分的快速檢測方法，有助于靈芝藥材的質量控制與現代劑型的開發。

表1 用乙醇或水配制的靈芝液實際樣品中GAA測定結果

3 結論

將分子印跡技術和電化學傳感器結合，采用電聚合的方法，以鄰苯二胺為功能單體，靈芝酸A為模板分子，在無需交聯劑條件下合成分子印跡聚合物，并利用IR和SEM對其進行結構和形貌表征。在最佳的試驗條件下，以靈芝酸A為模板分子，以鄰苯二胺為功能單體合成的分子印跡電化學傳感器具有良好的重現性、穩定性和選擇性，在1.0 pmol/L～1.0 μmol/L 范圍內，靈芝酸A的濃度(mol/L)和峰電流(μA)有良好的線性關系，擬合線性方程為Ip=18.2-0.710lgC，相關系數R2=0.995 1，檢出限為0.21 pmol/L，在靈芝實際樣品檢測中其回收率為98%～102%，具有良好的檢測性能。