基于HS-SPME-GC-O-MS和E-nose解析不同熱加工方式下西瓜籽特征性香氣差異

張茹茹 余雄偉 歐陽(yáng)輝 彭 武 徐瑋鍵 付琴利 李述剛

(1.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.武漢旭東食品有限公司，湖北 武漢 430000)

風(fēng)味是目前堅(jiān)果行業(yè)的一個(gè)熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。堅(jiān)果風(fēng)味易受品種、產(chǎn)地、貯運(yùn)條件、加工方式等因素影響。熱處理被認(rèn)為是堅(jiān)果提香加工的有效手段，然而大量的研究發(fā)現(xiàn)不同熱加工方式提香效果不同，如微波在山茶籽油[1]、腰果[2]中有較好的提香效果，烘烤使得小豆、豌豆風(fēng)味發(fā)生了很大變化[3]，而空氣油炸原理為熱風(fēng)干燥，即通過(guò)加熱絲加熱空氣，在內(nèi)部形成高速循環(huán)熱流以達(dá)到高溫干燥或烘烤的效果[4]。西瓜籽因其天然風(fēng)味寡淡在生產(chǎn)加工過(guò)程中關(guān)注度較低，目前對(duì)西瓜籽的研究多集中在蛋白質(zhì)和油脂的提取優(yōu)化及功能特性上[5-6]，而就熱加工對(duì)其風(fēng)味變化的研究更少。因此，為提升西瓜籽產(chǎn)品風(fēng)味，探究不同熱加工方式下西瓜籽風(fēng)味變化差異，構(gòu)建一種新型的產(chǎn)品香氣提升技術(shù)手段對(duì)休閑西瓜籽產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要的指導(dǎo)意義。

目前國(guó)內(nèi)外對(duì)于揮發(fā)性化合物的提取方法主要包括超臨界流體萃取、固相微萃取、頂空吸附等[7]，頂空固相微萃取—?dú)庀嗌V—嗅聞—質(zhì)譜技術(shù)(HS-SPME-GC-O-MS)因準(zhǔn)確性、高分離性和物質(zhì)鑒定的優(yōu)越性而被廣泛應(yīng)用于食品中揮發(fā)性成分的檢測(cè)[8-9]；電子鼻(E-nose)作為一種氣味檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)模仿人類(lèi)的嗅覺(jué)系統(tǒng)，對(duì)食品的新鮮度進(jìn)行快速和較低成本的感官信息分析[10]。近年來(lái)，多種技術(shù)相結(jié)合對(duì)食品中揮發(fā)性化合物進(jìn)行研究已經(jīng)成為熱門(mén)話題。Dou等[11]通過(guò)HS-SPME-GC-MS結(jié)合E-nose對(duì)3月和9月收獲的巴西和廣粉1號(hào)香蕉果實(shí)揮發(fā)性成分進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)3月收獲的香蕉醛類(lèi)物質(zhì)含量更高導(dǎo)致香蕉香氣更明顯。Zhang等[12]通過(guò)化學(xué)計(jì)量技術(shù)結(jié)合HS-SPME-GC-MS對(duì)熱風(fēng)干燥后的咖啡豆進(jìn)行了揮發(fā)性化合物分析，發(fā)現(xiàn)苯甲醛、D-檸檬烯、苯乙烯等物質(zhì)在干燥過(guò)程中含量較高；并通過(guò)E-nose對(duì)不同干燥時(shí)間處理下的咖啡豆進(jìn)行了區(qū)分。

研究擬以中國(guó)新疆維吾爾自治區(qū)產(chǎn)的西瓜籽為研究對(duì)象，借助HS-SPME-GC-O-MS和E-nose等技術(shù)手段，對(duì)比分析空氣油炸、微波和烘烤3種熱加工方式對(duì)西瓜籽特征性香氣影響，通過(guò)聚類(lèi)與相關(guān)性分析明確其特征性香氣成分，旨在為西瓜籽加工提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西瓜籽仁：市售；

環(huán)己酮：HPLC級(jí)，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；

微波爐：M1-L213C型，廣東省美的集團(tuán)有限公司；

空氣炸鍋：KL26-VF171型，山東省九陽(yáng)股份有限公司；

烤箱：X3U型，廣東省格蘭仕集團(tuán)有限公司；

恒溫水浴鍋：HH-8型，常州億通分析儀器制造有限公司；

電子天平：CP114型，奧豪斯儀器有限公司；

氣相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent5975C型，美國(guó)Agilent公司；

固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣器、固相微萃取纖維：50/30 μm CAR/PDMS/DVB型，美國(guó)Supelco公司；

電子鼻：PEN3.5型，德國(guó)Airsense公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品熱處理 參照Lemarcq等[13]的方法，略微修改：① 將西瓜籽仁(100 g)在微波爐中700 W處理3 min(MV)；② 將西瓜籽仁(100 g)在空氣炸鍋中160 ℃處理5 min(AO)；③ 將西瓜籽仁(100 g)在烤箱中150 ℃處理7 min(RT)。樣品處理后，冷卻至室溫，以未經(jīng)處理的西瓜籽仁(CK)作為對(duì)照組，使用前在-20 ℃保存，最多放置7 d。

1.2.2 氣相色譜—質(zhì)譜分析

(1)頂空固相微萃取條件：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g研磨好的西瓜籽樣品于20 mL頂空進(jìn)樣瓶中，向樣品中加入5 μL內(nèi)標(biāo)物(環(huán)己酮，18.94 μg/μL)后迅速密封。樣品在50 ℃水浴條件下平衡20 min后，插入老化30 min后的萃取頭，在50 ℃條件下萃取20 min，萃取結(jié)束后在GC-MS進(jìn)樣口(250 ℃)以不分流模式解析5 min。

(2)色譜條件：色譜柱為DB-WAX毛細(xì)管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；升溫程序?yàn)槠鹗紲囟?0 ℃，以5 ℃/min 升溫至200 ℃，保持2 min，再以5 ℃/min升溫至230 ℃，并保持2 min；載氣(He)流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，進(jìn)樣方式設(shè)置為不分流模式。

(3)質(zhì)譜條件：電子轟擊(EI)離子源；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，質(zhì)量掃描范圍為40～450(m/z)。

(4)定性方法：正構(gòu)烷烴混合物單獨(dú)進(jìn)樣，進(jìn)樣量5 μL，升溫程序和GC-MS 檢測(cè)條件一致，分離出的未知物與NIST 14.0譜庫(kù)進(jìn)行檢索，并與標(biāo)準(zhǔn)品的保留指數(shù)(RI)值進(jìn)行對(duì)比。按式(1)計(jì)算化合物保留指數(shù)。

(1)

式中：

RI,i——保留指數(shù)；

n——碳原子的個(gè)數(shù)；

Ti——待測(cè)組分的調(diào)整保留時(shí)間，min；

Tn——具有n個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時(shí)間，min；

Tn+1——具有n+1個(gè)碳原子的正構(gòu)烷烴調(diào)整保留時(shí)間，min。

(5)定量方法：使用內(nèi)標(biāo)法定量，環(huán)己酮(18.94 ng/mL)為內(nèi)標(biāo)物，并根據(jù)內(nèi)標(biāo)的質(zhì)量濃度計(jì)算樣品中揮發(fā)性化合物的質(zhì)量濃度，定量公式：

(2)

式中：

Cx,i——樣品中揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度，ng/mL；

Ci——內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度，ng/mL；

Ax——樣品中揮發(fā)性化合物的峰面積；

Ai——內(nèi)標(biāo)物的峰面積。

1.2.3 電子鼻分析 參照Hong等[14]的方法并修改。使用電子鼻對(duì)西瓜籽樣品進(jìn)行揮發(fā)性化合物分析，該分析儀器由10個(gè)傳感器組成，其類(lèi)型及性能描述詳見(jiàn)表1。電子鼻條件：準(zhǔn)確稱(chēng)取2.0 g研磨好的西瓜籽樣品置于20 mL 頂空瓶中，加蓋密封后在60 ℃水浴條件下平衡15 min，同時(shí)收集樣品中的揮發(fā)物。測(cè)量階段持續(xù)90 s，足以讓傳感器達(dá)到穩(wěn)定的信號(hào)值。傳感器清洗時(shí)間為100 s，載氣流速為400 mL/min。

表1 PEN3.5電子鼻中各個(gè)傳感器的響應(yīng)類(lèi)型

1.2.4 氣味活度值(OAV)的計(jì)算 按式(3)計(jì)算從西瓜籽樣品中獲得的所有氣味劑的OAV，即每種化合物的濃度(由HS-SPME-GC-O-MS定量分析獲得)與水中相對(duì)應(yīng)的氣味閾值的比率[15]。

(3)

式中：

OAV,i——?dú)馕痘疃戎担?/p>

Ci——揮發(fā)性化合物質(zhì)量濃度，ng/mL；

Ti——化合物氣味閾值，mg/kg。

1.2.5 感官分析 選取6名感官敏銳的成員(3名女性和3名男性，年齡20～30歲)對(duì)4種樣品進(jìn)行感官評(píng)估。選取6個(gè)芳香屬性來(lái)評(píng)估4種樣品的香氣特征，即清香、果香、焦香、油脂香、烤堅(jiān)果香、綠色，并使用以下評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估6種不同氣味的強(qiáng)度：1(極弱)，3(弱)，5(中)，7(強(qiáng))，9(非常強(qiáng))[16]。不同小組成員對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行3次評(píng)估，數(shù)據(jù)表示為平均值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用方差分析(AVOVA)分析統(tǒng)計(jì)差異，顯著性水平為0.05，確定不同熱處理方式下的明顯差異；使用統(tǒng)計(jì)SPSS軟件(v17.0，SPSSInc.，Chicago，IL，USA)分析；使用在線工具M(jìn)etabo Analyst 5.0(https://www.metaboanalyst.ca/)進(jìn)行主成分分析(PCA)；聚類(lèi)熱圖和雷達(dá)圖分別由TBTools1.098軟件和Origin8軟件(OriginLab Inc.，USA)進(jìn)行繪制；使用 Unscrambler 10.4(CAMOASA，Oslo，Norway)進(jìn)行偏最小二乘回歸(PLSR)分析西瓜籽樣品、感官屬性和關(guān)鍵香氣化合物之間的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 西瓜籽樣品的香氣成分分析

堅(jiān)果中的特征性風(fēng)味主要來(lái)源于揮發(fā)性化合物，西瓜籽本身帶有的清香以及熱加工后特有的堅(jiān)果風(fēng)味已經(jīng)成為消費(fèi)者選擇的主要影響因素。由表2可知，研究共檢測(cè)出115種揮發(fā)性化合物，其中CK 37種、AO 58種、MV 63種和RT 44種，具體包含醇類(lèi)27種，吡嗪類(lèi)16種，烯烴類(lèi)12種，醛類(lèi)和酮類(lèi)各10種，酯類(lèi)、烷烴類(lèi)和苯環(huán)類(lèi)各8種，吡啶類(lèi)3種，呋喃類(lèi)和吡咯類(lèi)各2種，醚類(lèi)、酚類(lèi)、咔唑類(lèi)、吡唑類(lèi)、噠嗪類(lèi)和噻唑類(lèi)各1種以及其他類(lèi)揮發(fā)性化合物3種，詳細(xì)信息見(jiàn)表2。

表2 加工方式對(duì)西瓜籽樣品揮發(fā)性化合物含量的影響

如圖1所示，熱加工方式對(duì)西瓜籽風(fēng)味影響顯著(P<0.05)。其揮發(fā)性化合物峰面積大小依次為MV>AO>RT>CK，說(shuō)明熱加工方式對(duì)西瓜籽具有不同的提香效果，其中MV的提香效果最佳。各處理組中醇類(lèi)物質(zhì)變化顯著(P<0.05)，CK、AO、MV、RT 4組樣品中醇類(lèi)物質(zhì)含量分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的40.3%，22.5%，9.3%，41.9%，為西瓜籽提供濃郁的水果清香[12]；相比于CK組，各處理組中均檢測(cè)到較高含量的己醛，分別占AO、MV、RT的揮發(fā)性物質(zhì)總量的13.7%，5.4%，2.0%，為產(chǎn)品提供清香、果香、木香[17]；D-檸檬烯作為典型的烯烴類(lèi)化合物在CK、AO、MV、RT中均被檢測(cè)到，其含量分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的11.5%，4.5%，5.0%，8.3%，為西瓜籽提供柑橘、薄荷香氣[18]；據(jù)報(bào)道[16-20]，吡嗪類(lèi)化合物是高溫處理下美拉德反應(yīng)的特定產(chǎn)物，為食品提供了獨(dú)特的烘烤、堅(jiān)果、焦香和爆米花樣香氣，在AO、MV、RT樣品中分別檢測(cè)出9，14，3種吡嗪類(lèi)化合物，分別占揮發(fā)性物質(zhì)總量的28.4%，53.3%，9.6%；其中4組樣品中2,5-二甲基吡嗪含量最高，分別占總揮發(fā)性物質(zhì)的17.2%，23.3%，6.2%，為西瓜籽提供可可、烤堅(jiān)果、烤肉等香氣[20]。

圖1 不同熱加工方式下西瓜籽揮發(fā)性化合物的相對(duì)峰面積和峰面積

綜上所述，熱加工方式對(duì)西瓜籽特征香氣影響顯著，CK樣品組中以醇類(lèi)、烯烴類(lèi)化合物為主，AO、MV中則以醛類(lèi)、吡嗪類(lèi)化合物為主，而RT中則以醇類(lèi)、吡嗪類(lèi)化合物為主。相比于空氣油炸與烘烤，微波處理下樣品香氣最為濃郁，其中2,5-二甲基吡嗪含量高達(dá)23.3%，使西瓜籽呈現(xiàn)典型的烤堅(jiān)果香。

2.2 氣味活度值(OAV)分析

OAV用于評(píng)估香氣化合物對(duì)于堅(jiān)果氣味的貢獻(xiàn)，一般認(rèn)為OAV>1的化合物對(duì)樣品特征香氣具有積極作用[21]。4組樣品中，共檢出45種OAV>1的化合物，為更加直觀了解這些化合物在西瓜籽整體風(fēng)味中的作用，將其進(jìn)行熱圖分析。如圖2所示，CK、AO、MV、RT 4組樣品中OAV>1的化合物分別有17，24，23，21種。CK中D-檸檬烯、正己醇、草蒿腦的OAV值較高，為西瓜籽提供柑橘、薄荷、甘草香；AO中D-檸檬烯、己醛的OAV值較高，為西瓜籽提供柑橘、脂肪、杏仁香；MV中2-乙基-5-甲基吡嗪、己醛的OAV值較高，為西瓜籽提供可可、烤牛肉以及明顯的烤堅(jiān)果風(fēng)味；RT中正己醇、己醛的OAV值較高，為西瓜籽提供青草、脂肪香。

圖2 不同熱加工處理下西瓜籽樣品中揮發(fā)性化合物(OAV>1)的熱圖

經(jīng)過(guò)熱加工西瓜籽整體香氣由淺淡的清香向明顯的烤堅(jiān)果香轉(zhuǎn)變，可能是由于低揮發(fā)性的醇類(lèi)等物質(zhì)在熱加工后損失，而高溫處理后美拉德反應(yīng)產(chǎn)生的醛類(lèi)和吡嗪類(lèi)化合物顯著增加導(dǎo)致的風(fēng)味變化[1]。其中MV組樣品具有最為明顯的烤堅(jiān)果香，表明微波處理是3種熱加工方式中最佳的西瓜籽提香方式，與GC-MS分析結(jié)果相符。

2.3 感官評(píng)價(jià)

如圖3所示，CK的香氣特征主要為清香、果香、綠色，而3種熱加工樣品主要集中在焦香、油脂香、烤堅(jiān)果香，其中AO的整體香氣略弱于MV和RT組。MV、RT兩組樣品整體風(fēng)味最為接近，但RT組可能由于樣品焦香味太重，覆蓋了部分烤堅(jiān)果香味，整體來(lái)說(shuō)風(fēng)味略低。MV組樣品的烤堅(jiān)果香味在4組樣品中最強(qiáng)，對(duì)西瓜籽樣品整體香氣起到了最大貢獻(xiàn)。總體而言，4種西瓜籽樣品之間的感官差異明顯，表明西瓜籽的香氣特性在熱加工后會(huì)發(fā)生顯著變化，且微波處理對(duì)西瓜籽的提香效果最好，與GC-MS分析結(jié)果一致。

圖3 不同熱加工處理下西瓜籽樣品的香氣分布差異圖

2.4 電子鼻分析

研究通過(guò)電子鼻對(duì)西瓜籽4種樣品進(jìn)行了香氣特征評(píng)估，并將69～71 s的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成雷達(dá)圖，見(jiàn)圖4。對(duì)于CK樣品，在傳感器W1W、W5S、W2W處給出了較強(qiáng)的響應(yīng)。與CK相比，AO、MV、RT整體風(fēng)味的輪廓相似，但W1W響應(yīng)更強(qiáng)，W1S響應(yīng)減弱。3種熱加工方式相對(duì)比，RT在W1W、W2W、W5S傳感器中提供了較強(qiáng)的響應(yīng)值，此外，在整個(gè)檢測(cè)過(guò)程中，RT樣品的響應(yīng)值較高，而AO樣品中傳感器的響應(yīng)值較低。這些結(jié)果表明，未處理與熱加工后的西瓜籽樣品之間存在顯著差異，且不同熱加工方式之間存在差異。

圖4 不同處理下西瓜籽樣品的雷達(dá)圖

對(duì)電子鼻的數(shù)據(jù)進(jìn)行了PCA分析，結(jié)果表明，第一方差占比50.20%，第二方差占比37.78%，總方差為87.98%，大于85%，表明該P(yáng)CA圖可以很好地解釋大部分?jǐn)?shù)據(jù)。如圖5所示，生西瓜籽的數(shù)據(jù)主要在左下象限處檢測(cè)到，與3種熱處理的西瓜籽樣品明顯分開(kāi)，說(shuō)明熱處理明顯改變了西瓜籽的揮發(fā)性化合物。AO與MV樣品距離較近，主要是與兩種加工方式下西瓜籽樣品風(fēng)味都具有較為明顯的烤堅(jiān)果香相關(guān)，這與OAV值的分析相對(duì)應(yīng)。RT組數(shù)據(jù)主要在右側(cè)檢測(cè)到，與其余3組相距較遠(yuǎn)，與GC-MS中得到的結(jié)果相對(duì)應(yīng)。由此可知，電子鼻的PCA能夠較好地表征西瓜籽樣品，并且能夠有效地區(qū)分不同熱加工方式下的西瓜籽樣品之間的風(fēng)味差異。

圖5 不同熱加工處理下西瓜籽樣品電子鼻的PCA分析

2.5 西瓜籽樣品主要芳香化合物與感官屬性之間的相關(guān)性分析

采用偏最小二乘回歸(PLSR)法確認(rèn)從4種樣品中鑒定出來(lái)的主要芳香化合物與感官屬性之間的相關(guān)性。根據(jù)每組樣品中檢測(cè)到的化合物峰面積，分別選取5種實(shí)際峰面積最大的化合物作為主要的揮發(fā)性成分，共13種化合物，分別為D-檸檬烯、正己醇、環(huán)己醇、2,6-二羥基苯乙酮、草蒿腦、戊醛、己醛、1-戊醇、2,5-二甲基-吡嗪、甲基吡嗪、2-乙基-5-甲基-吡嗪、三甲基吡嗪、2-乙基環(huán)丁酮。如圖6所示，PLSR解釋了88%的X-方差(11種主要芳香化合物)與84%的Y-方差(6個(gè)感官屬性)，內(nèi)外兩個(gè)橢圓分別顯示了解釋方差的50%與100%。所有的方差都被放置于兩個(gè)橢圓中，表明其可以很好地被PLSR模型解釋。

圖6中，“油脂香”“烤堅(jiān)果香”“焦香”屬性與吡嗪類(lèi)化合物、醛類(lèi)化合物以及D-檸檬烯呈正相關(guān)關(guān)系，“清香”“果香”“綠色”屬性與環(huán)己醇及草蒿腦呈正相關(guān)關(guān)系。然而，正己醇以及1-戊醇與任何感官屬性的相關(guān)性較弱。這些結(jié)果與感官評(píng)估及GC-MS分析相對(duì)應(yīng)。“烤堅(jiān)果香”“油脂香”屬性受到吡嗪類(lèi)揮發(fā)性化合物的強(qiáng)烈影響；“烤堅(jiān)果香”“焦香”屬性與己醛、戊醛相關(guān)性較高，與Lin等[22]對(duì)松子的研究相似。

圖6 不同熱加工處理下西瓜籽樣品的感官屬性與主要芳香化合物在PLSR上的載荷分布

3 結(jié)論

利用電子鼻和頂空固相微萃取—?dú)庀嗌V—嗅聞—質(zhì)譜技術(shù)對(duì)不同熱加工處理的西瓜籽芳香特征和關(guān)鍵芳香化合物進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示，4組西瓜籽的揮發(fā)性化合物有明顯不同，且主成分分析與電子鼻相結(jié)合，在西瓜籽樣品中顯示出良好的鑒別力；相比較而言，微波處理比空氣油炸和烘制加工對(duì)西瓜籽風(fēng)味提升更為明顯，其中2,5-二甲基吡嗪、甲基吡嗪和三甲基吡嗪等吡嗪類(lèi)揮發(fā)性化合物為整體風(fēng)味做出了重大貢獻(xiàn)。研究系統(tǒng)分析了不同熱加工方式對(duì)西瓜籽揮發(fā)性成分的變化及特征性香氣的影響，表明熱加工方式對(duì)西瓜籽特征香氣影響顯著，這對(duì)提升西瓜籽產(chǎn)品品質(zhì)有著重要作用。熱加工方式能夠促進(jìn)西瓜籽風(fēng)味物質(zhì)的形成，關(guān)于其醛類(lèi)、醇類(lèi)、吡嗪類(lèi)等風(fēng)味物質(zhì)的代謝途徑和影響機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。