冠突散囊菌對酒曲糖化能力的影響及其機制研究

楊鳳英，秦洋*

1(邵陽學(xué)院 食品與化學(xué)工程學(xué)院，湖南 邵陽，422000) 2(生態(tài)釀酒新技術(shù)與應(yīng)用湖南省高校重點實驗室(邵陽學(xué)院)，湖南 邵陽，422000)

高粱、糯米、小麥、大米、玉米作為五糧型白酒釀造的主要原料，高含量的支鏈淀粉直接影響白酒的產(chǎn)量[1]。所以提高出酒率、糖化效率是釀酒工作的重點[2]，對白酒生產(chǎn)具有重要意義。

酒曲微生物區(qū)系分為霉菌(糖化)、細菌(產(chǎn)香)和酵母菌(發(fā)酵)，其中根霉屬為起到糖化作用的主要微生物[3]。通過適宜的方式提高酒曲糖化能力，是當(dāng)前研究熱點之一。研究顯示，冠突散囊菌(Eurotiumcritatum)能夠分泌淀粉酶，將淀粉分解為小分子糖，供自身生長，且生長條件與霉菌相似[4]。這一生物學(xué)性質(zhì)為E.critatum與根霉屬的協(xié)同糖化提供了重要的理論依據(jù)。此外，E.critatum作為一種益生菌，具有抑菌、降血糖、抗氧化等功效[5-6]。然而，在食品發(fā)酵領(lǐng)域，主要應(yīng)用于茶葉、谷類等發(fā)酵[5,7]，在白酒釀造領(lǐng)域的研究鮮有報道。因此，利用E.critatum與根霉協(xié)同糖化并研究其影響機制，具有重要的意義及創(chuàng)新性。

糖化的本質(zhì)是淀粉的水解[8]。因此，淀粉分子的一系列變化，包括直鏈淀粉比例、分子聚合度、晶體結(jié)構(gòu)、微觀形態(tài)等均能夠直觀地反映出糖化的效率[9-10]。隨著現(xiàn)代分析手段的不斷發(fā)展，從淀粉分子的系列變化分析糖化效率發(fā)生改變的作用機制，已成為不可或缺的分析手段。

本實驗中，采用E.critatum與根霉協(xié)同糖化，通過添加E.critatum、酵母菌、根霉(以甜酒曲作為載體)和無菌水培養(yǎng)的酒曲，在相同條件下對糧醅進行糖化發(fā)酵。通過分析糧醅還原糖含量分析E.critatum對酒曲糖化能力的影響，并得出最佳的糖化工藝。同時，通過分析酒曲淀粉分子的系列變化分析E.critatum對酒曲糖化能力的影響機理，為E.critatum在白酒糖化發(fā)酵領(lǐng)域的應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料：五糧，市售；制曲原料(小麥、稻殼等)，湖南湘窖酒業(yè)股份有限公司。

菌種：E.critatum，北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院；釀酒酵母，本實驗室保存；甜酒曲(根霉菌約為1×106CFU/mL)，安琪酵母股份有限公司。

96%直鏈淀粉、87.2%支鏈淀粉、聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate, PMMA)，北京中科質(zhì)檢生物技術(shù)有限公司；C6H12O6、NaOH、HCl,均為分析純，上海康朗生物科技有限公司；DMSO試劑(色譜純)，南京化學(xué)試劑股份有限公司；察氏瓊脂培養(yǎng)基，YPD培養(yǎng)基，杭州西頓生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HR-T16M臺式高速冷凍離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；XD-3型X射線衍射儀、Tescan Mi-ra3掃描電子顯微鏡，上海永傲精密儀器有限公司；Epoch全波長酶標儀、1525型凝膠滲透色譜儀、2414檢測器、Agilent PLgel 5 μm MIXED-C色譜柱，美國沃特世有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗室進行糧食預(yù)處理

選擇無霉變的糧食，將玉米粉碎至20目，按照經(jīng)典五糧配方[11]，每份樣品50 g糧食(干重)，3組平行，進行溫水潤糧12 h，用紗布過濾水分，放入蒸鍋中蒸2.5 h，將蒸好的糧食攤涼至35 ℃，裝罐。

1.3.2 菌懸液的準備

將E.critatum在察氏瓊脂培養(yǎng)基上活化，酵母菌在YPD培養(yǎng)基上活化，選取長勢較好的單菌落，在液體培養(yǎng)基上擴培。分別在恒溫振蕩器上28 ℃、150 r/min培養(yǎng)5 d，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)12 h得到實驗菌種，最終E.critatum濃度約為(1×105CFU/mL)，酵母菌濃度約為(1×106CFU/mL)。

1.3.3E.critatum與甜酒曲對糧醅糖化效率的影響

將30份100 g糯米浸泡12 h，用紗布過濾水分，蒸30 min，冷卻至35 ℃裝罐，分別加入5、10、15、20、25 mLE.critatum菌液，甜酒曲為0.4 g/100 g，3組平行，攪拌均勻，密封放置于培養(yǎng)箱，32 ℃培養(yǎng)糖化5 d，測定糧醅還原糖含量。

分別加入0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/100 g甜酒曲，E.critatum菌液20 mL/100 g，方法同上進行糖化。

1.3.4 單因素試驗

1.3.4.1E.critatum菌液添加量的確定

100 g空白曲中分別加入0、5、10、15、20、25 mLE.critatum菌液，酵母菌6 mL/100 g，甜酒曲2 g/100 g，水分含量44%，制成不同濃度的E.critatum的酒曲在曲房進行培養(yǎng)，分別取10 g曲粉到1.3.1糧食樣品中，進行實驗室釀酒實驗，32 ℃發(fā)酵7 d，根據(jù)糧醅還原糖含量優(yōu)選3個較好的E.critatum添加量進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

1.3.4.2 酵母菌液添加量的確定

酵母菌在白酒釀造過程中不可缺失，是白酒釀造微生物中重要的菌群之一。方法同上，分別加入0、2、4、6、8、10 mL/100 g酵母菌菌液，E.critatum15 mL/100 g，甜酒曲2 g/100 g，水分含量44%，根據(jù)糧醅還原糖含量優(yōu)選3個較好的酵母菌液添加量進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

1.3.4.3 甜酒曲添加量的確定

傳統(tǒng)酒曲中主要是根霉起到糖化作用，為了區(qū)分根霉的添加是否會影響E.critatum對酒曲的糖化能力。方法同上，分別加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 g/100 g甜酒曲，E.critatum15 mL/100 g，水分含量44%，酵母菌菌液6 mL/100 g，根據(jù)糧醅還原糖含量優(yōu)選3個較好的甜酒曲添加量進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

1.3.4.4 酒曲水分含量的確定

為了區(qū)分是菌種對酒曲本身還是水分含量的作用，方法同上，水分含量分別控制在26%、32%、38%、44%、50%、56%，E.critatum15 mL/100 g，甜酒曲2 g/100 g，酵母菌菌液6 mL/100 g，根據(jù)糧醅還原糖含量優(yōu)選3個較好的水分含量進行后續(xù)響應(yīng)面優(yōu)化實驗。

1.3.5 響應(yīng)面分析實驗

按表1制成不同的酒曲，方法同1.3.4，采用 Box-Behnken設(shè)計原理進行響應(yīng)面分析實驗。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.6 糧醅還原糖含量和酸度測定方法

參照DB34/T 2264—2014《固態(tài)發(fā)酵酒醅分析方法》。

1.3.7 酒曲淀粉提取

酒曲浸泡2 h后打漿，漿液過80目篩，靜置倒出上清液，沉淀用0.2%(質(zhì)量分數(shù))NaOH溶液[12]浸提攪拌4 h(料液比1∶5,g∶mL)，倒出上清液，用純水洗至清澈，4 000 r/min離心10 min，刮掉上層黃色物，洗滌沉淀重復(fù)離心3次，將淀粉沉淀在40 ℃下烘干24 h，過200目篩保存。

1.3.8 酒曲支/直鏈淀粉含量測定方法

參照焦夢悅等[13]的雙標單波長法測支鏈淀粉含量，以吸光度為縱坐標，支鏈淀粉含量為橫坐標，繪制標準曲線。標準曲線方程為y=-0.007 3x+0.795 7，R2=0.997 4。直鏈淀粉含量按公式(1)計算：

直鏈淀粉含量=100%-支鏈淀粉含量

(1)

1.3.9 酒曲淀粉分子質(zhì)量分布測量

依次將分子質(zhì)量為0、2%、4%、6%、8%、10%、12%、14%、16%、18%的PMMA標準品過柱并記錄各自的保留時間。以分子質(zhì)量(Da)為縱坐標，保留時間(min)為橫坐標繪制標準曲線，標準曲線方程為y=-0.586 4x+13.059，R2=0.998 4，之后將待測淀粉樣品溶解過柱，根據(jù)其保留時間按照標準曲線方程計算其分子質(zhì)量分布。

凝膠滲透色譜(gel permeation chromatography, GPC)前處理方法：8 mg樣品溶于4 mL DMSO試劑，溶解6 h，用0.45 μm濾膜過濾后上機測試。檢測條件：Waters 2414示差檢測器，色譜柱Agilent PLgel 5 μm MIXED-C，流動相為DMSO試劑，流速1 mL/min，2 mg/mL，進樣50 μL，檢測柱溫35 ℃，檢測35 min[14]。

1.3.10 酒曲淀粉微觀結(jié)構(gòu)

參照陳青[15]的方法進行測定。

1.3.11 酒曲淀粉結(jié)晶度

前處理方法：直接上機。操作條件為：起始角2θ為10°，終止角2θ為80°，掃描速度8 °/min，參照SUN等[16]的方法進行實驗。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運用SPSS Statistics 22軟件進行數(shù)據(jù)處理分析，且每組實驗重復(fù)3次(結(jié)果均以平均值±標準差表示)并進行相關(guān)性分析，應(yīng)用Origin 2019畫圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 E.critatum與甜酒曲對糧醅糖化效率的影響

如圖1-a和圖1-b所示，當(dāng)甜酒曲添加量低于0.6 g/100 g時，E.critatum低于15 mL/100 g時，糧醅還原糖含量逐漸上升，由此可知，甜酒曲中的根霉與E.critatum具有良好的協(xié)同糖化作用，甜酒曲高于0.6 g/100 g時，E.critatum高于15 mL/100 g時，這種趨勢不再明顯，可能原因是E.critatum與根霉數(shù)量增加，在有限的O2和碳源條件下，不再進行糖化作用。所以，適宜的E.critatum與甜酒曲添加量在合適的條件下具有良好的協(xié)同糖化作用。

a-甜酒曲；b-E.critatum菌液圖1 甜酒曲、E.critatum菌液對糧醅 還原糖含量的影響Fig.1 Effects on the reducing sugar content of fermented grains by Jiuqu and E.critatum

2.2 E.critatum對酒曲糖化能力的影響

圖2-a結(jié)果顯示，當(dāng)E.critatum菌液添加量低于10 mL/100 g時，糧醅還原糖含量隨E.critatum的增加而增加。可見在一定范圍內(nèi)，E.critatum有利于酒曲的協(xié)同糖化作用。當(dāng)E.critatum添加量高于10 mL/100 g時，這種趨勢不再明顯。可能的原因是大量的菌液在培曲過程中需要足夠的碳源，與細菌、酵母有一定的競爭關(guān)系[17]，反而不利于E.critatum的生長繁殖[18]。糖化是在微酸性條件下進行，酸度過高不利于糧醅糖化，因此，較為理想的E.critatum添加量為10 mL/100 g。

2.3 酵母菌對酒曲糖化能力的影響

圖2-b結(jié)果顯示，當(dāng)酵母菌液添加量低于4 mL/100 g時，酒曲在培養(yǎng)過程中，合適的酵母菌菌液增加與霉菌的生長與代謝保持較高的協(xié)同性，酒曲具有良好的糖化能力，還原糖含量增加。當(dāng)酵母菌液添加量高于4 mL/100 g時，這種趨勢不再明顯，可能的原因是過量的酵母菌在酒曲培養(yǎng)過程中將小分子糖發(fā)酵為酒精[19]，抑制酒曲中糖化作用的微生物生長，發(fā)酵的糧醅酸度緩慢上升，還原糖逐漸下降[20]。所以適當(dāng)添加酵母有利于酒曲培養(yǎng)過程中酵母、根霉的相互適應(yīng)及良好生長。因此，較為理想的酵母液添加量為4 mL/100 g。

2.4 甜酒曲對酒曲糖化能力的影響

如圖2-c所示，當(dāng)甜酒曲添加量低于1.0 g/100 g時，糧醅還原糖含量隨甜酒曲的增加而增加。可見在一定范圍內(nèi)，根霉菌有利于酒曲的協(xié)同糖化作用。當(dāng)甜酒曲添加量高于1.0 g/100 g時，這種趨勢不再明顯，糧醅酸度隨著甜酒曲的增加而增加。可能的原因是酸度過高不利于E.critatum與根霉菌的糖化，糧醅還原糖含量緩慢降低[21]。因此，較為理想的甜酒曲添加量為1.0 g/100 g。

a-E.critatum菌液；b-酵母菌液；c-甜酒曲；d-酒曲水分含量圖2 E.critatum菌液、酵母菌液、甜酒曲、水分含量對糧醅還原糖含量和酸度的影響Fig.2 Effects of E.critatum liquid, yeast liquid, Jiuqu and water content on the reducing sugar content and acidity of fermented grains

2.5 水分對酒曲糖化能力的影響

圖2-d結(jié)果顯示，當(dāng)水分含量低于38%時，糧醅還原糖含量隨水分含量的增加而增加。可見在一定范圍內(nèi)，水分有利于酒曲中糖化作用微生物生長，有利于酒曲的協(xié)同糖化作用。當(dāng)水分含量高于38%時，這種趨勢不再明顯。可能的原因是水分含量過高時，微生物生長緩慢。水分含量過低時曲坯中水分散失過快，不利于微生物的生長代謝活動[22]。糧醅酸度變化與還原糖含量變化趨勢一樣，因此，較為理想的水分含量為38%。

2.6 響應(yīng)面分析結(jié)果

2.6.1 響應(yīng)面結(jié)果

由響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計得出最佳還原糖含量的計算如公式(2)所示：

還原糖含量=6.54-0.21A+0.46B+0.41C-0.48D+0.092AB-0.62AC+0.47AD+0.22BC+0.24BD-0.40CD-1.81A2-0.80B2-0.90C2-1.00D2

(2)

2.6.2 方差及可信度分析

由表2可知，模型差異極顯著；失擬項差異不顯著。4個因素均對響應(yīng)指標糧醅還原糖含量具有顯著影響，對糧醅還原糖含量的影響程度大小為D>B>C>A。Pred R2與Adj R2差值小于0.2。F值越大，說明兩兩交互作用越好，AC兩兩交互作用最佳，其次為AD。圖3結(jié)果與響應(yīng)面二次模型方差分析結(jié)果一致。坡度相對陡峭，表明響應(yīng)值對于處理條件的改變非常敏感。

表2 回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果Table 2 Analysis of variance and significance results of regression model

圖3 AC和AD因素交互作用對還原糖含量 影響的響應(yīng)曲面Fig.3 Response surface of the interaction of AC and AD factors on reducing sugar content

2.6.3 驗證實驗

通過Design-Expert 10軟件進行數(shù)據(jù)分析，得到酒曲的最優(yōu)條件：考慮實際生產(chǎn)條件，最佳發(fā)酵條件調(diào)整添加量為酵母菌為3.68 mL/100 g，E.critatum為11.43 mL/100 g，甜酒曲為1.692 g/100 g，水分為36.08%。進行3次驗證實驗，實驗糧醅還原糖含量為(6.95±0.25) g/100 g，與模型預(yù)測值差異不大。

因此，由上述實驗結(jié)果可知：E.critatum有助于酒曲的協(xié)同糖化，提高了糧醅糖化效率。

2.7 E.critatum對酒曲直鏈淀粉含量的影響

通過研究優(yōu)化組酒曲淀粉(樣品A)與傳統(tǒng)酒曲淀粉(樣品B)的系列變化分析E.critatum對酒曲糖化能力的作用機制。

由1.3.8計算出樣品A、樣品B和制曲原料小麥支鏈淀粉含量分別為(57.26±1.49)%、(60.49±1.44)%、(67.74±1.54)%；直鏈淀粉含量分別為(42.74±1.11)%、(39.51±1.39)%、(32.26±1.24)%；支直比分別為1.34∶1、1.53∶1、2.10∶1。

在E.critatum對酒曲直鏈淀粉含量的影響下。樣品A的支鏈淀粉含量相對于小麥降低了10.48%，比樣品B降低了3.23%，樣品A直鏈淀粉含量相對于小麥增加了，比樣品B高。支鏈淀粉被酶水解為直鏈淀粉，淀粉的支直比越低，表明支鏈淀粉含量水解程度越高[23]即冠突散囊菌促進了淀粉分子的水解作用。酒曲作為投糧產(chǎn)生作用，可以提高糧食利用率[24]。可見，E.critatum有利于酒曲的協(xié)同糖化作用。

2.8 E.critatum對酒曲淀粉分子質(zhì)量分布的影響

由表3可知，樣品A淀粉分子質(zhì)量0.2×105～1.0×105Da的占比為64%，B占比為59%；淀粉分子質(zhì)量20 000 Da以下樣品A占比為25%，B占比為30%。說明樣品A淀粉分子質(zhì)量分布越小，越集中。B平均分子質(zhì)量為96 930 Da，A為94 325 Da，平均分子質(zhì)量比B小，表明小分子淀粉含量增加。由2.7可知，樣品A的直鏈淀粉含量比B高，可以推測經(jīng)過E.critatum對酒曲的協(xié)同糖化作用后，部分大分子淀粉被水解而導(dǎo)致淀粉平均分子質(zhì)量降低[25]，說明實驗組酒曲將淀粉大分子水解的能力比傳統(tǒng)酒曲強。

表3 實驗組酒曲(樣品A)與傳統(tǒng)酒曲(樣品B)的 淀粉GPC結(jié)果Table 3 GPC results of experimental group Jiuqu starch (sample A) and traditional Jiuqu starch (sample B)

2.9 E.critatum對酒曲淀粉微觀結(jié)構(gòu)的影響

由圖4可知，兩者淀粉分子呈扁圓形、不規(guī)則形態(tài)，直徑在20 μm左右，小于10 μm淀粉顆粒表面比較光滑。樣品A大多數(shù)淀粉上有裂紋，裂紋處有大凹痕和小孔，樣品B淀粉上有少許凹痕，相對于A，淀粉B比較圓潤，小顆粒淀粉占比多于A，由GPC數(shù)據(jù)得出，樣品A淀粉分子質(zhì)量分布小于B，比B集中，與掃描電鏡結(jié)果符合。從2.7得知，樣品B直鏈淀粉含量比A低[26]，直鏈淀粉處于淀粉顆粒內(nèi)部，支鏈淀粉分布在外層，A淀粉表面支鏈淀粉被分解為小分子淀粉，說明E.critatum對酒曲的協(xié)同糖化會對淀粉顆粒有分解作用。

a-實驗組酒曲；b-傳統(tǒng)酒曲圖4 酒曲的淀粉掃描電鏡圖Fig.4 SEM photographs of Jiuqu starches

2.10 E.critatum對酒曲淀粉結(jié)晶度的影響

如圖5所示，樣品A和B淀粉的X-射線衍射均在2θ為15°、17°、18°、20°、23°、27°出現(xiàn)峰值，A在2θ為27°峰比較明顯，有研究發(fā)現(xiàn)小麥粉的淀粉在2θ為15°、17°、18°、23°出現(xiàn)峰值，小麥淀粉結(jié)晶度是20%～23%[27]。樣品A淀粉的結(jié)晶度為17.96%，B淀粉的結(jié)晶度為18.92%，相對于小麥淀粉結(jié)晶度有所降低，可能原因是B小顆粒淀粉占比多于A，A直鏈淀粉含量高，造成結(jié)晶度低，所以E.critatum對酒曲的協(xié)同糖化可以促進支鏈淀粉的水解，使直鏈淀粉增加，淀粉結(jié)晶度與直鏈淀粉含量相關(guān)[28]，淀粉顆粒上的裂紋導(dǎo)致A淀粉結(jié)晶度減弱，減少了結(jié)晶面積[29]。

圖5 酒曲淀粉X-衍射圖Fig.5 XRD curves of Jiuqu starches

綜上，實驗組A的直鏈淀粉含量增加，淀粉平均分子質(zhì)量減少，掃描電鏡圖顯示高含量的直鏈淀粉和淀粉顆粒上的裂紋造成了A淀粉結(jié)晶度比B結(jié)晶度低，E.critatum對酒曲的協(xié)同糖化作用明顯比傳統(tǒng)酒曲水解支鏈淀粉能力增強，糖化作用增強。

3 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，E.critatum可以提高糧醅的還原糖含量，提高酒曲的糖化效率，最佳條件為酵母菌添加量為3.68 mL/100 g，E.critatum添加量為11.43 mL/100 g，甜酒曲添加量為1.692 g/100 g，酒曲水分含量為36.08%；添加有E.critatum的實驗組酒曲直鏈淀粉含量增加，GPC顯示淀粉分子質(zhì)量降低，掃描電鏡圖淀粉結(jié)構(gòu)變化明顯，X-衍射結(jié)晶度降低，晶體結(jié)構(gòu)明顯，這些現(xiàn)象表明淀粉分子表達了E.critatum與根霉協(xié)同糖化下的作用機理。

本實驗培曲條件有限，培曲的量與實際培曲有差別，采用的是實驗室釀酒實驗，沒有進行工業(yè)化，但是得到的結(jié)果比較明顯，后續(xù)可基于E.critatum的糖化機理，作用于其他酒曲和白酒工業(yè)化生產(chǎn)，以提高酒曲糖化能力，并提高糧食利用率和出酒率。