丙氨酸制備研究進展

陸捷，王國棟，王瑞明,2，汪俊卿,2*

1(齊魯工業大學(山東省科學院)，生物工程學部，山東 濟南，250353) 2(齊魯工業大學(山東省科學院)，生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室，山東 濟南，250353)

丙氨酸，又名氨基丙酸，其化學式為C3H7NO2，分子質量為89.09，呈白色結晶粉末狀，無毒無臭，在水中易溶，在乙醇中微溶，在乙醚和丙醇中不溶，熔點為297 ℃，密度為1.432 g/cm3[1-2]，化學性能穩定。丙氨酸分子內包括羧基、氨基，是組成人體蛋白質結構的一類中性氨基酸。丙氨酸有2種同分異構體，分別為α型和β型，其中α型丙氨酸分子又存在L型、D型立體鏡像[3]，DL-丙氨酸為α-丙氨酸的外消旋體。丙氨酸具有重要的生理學功能，如參與糖代謝活動，它在轉氨反應中提供氨基，并參與體內的代謝循環，將氨基酸轉化為糖原。化學法是生產丙氨酸的傳統方法。然而，丙氨酸生產的化工流程溫度高、壓力大、酸堿強，環境污染嚴重。因此，工業化生產丙氨酸采用發酵法和微生物酶法代替了原有的化學合成法。根據目前丙氨酸的國際市場調查，丙氨酸產業在世界分布廣泛，以美國、歐洲、中國為主，我國是最大的生產國，我國境內丙氨酸公司主要生產L-丙氨酸、D-丙氨酸和DL-丙氨酸，盡管β-丙氨酸等占比較低，但發展環境較穩定，對該領域的需求也在不斷增長，在未來市場非常有發展前景。

1 丙氨酸的應用

1.1 丙氨酸在食品領域中的應用

在食品領域，丙氨酸是一種兼具甜味與鮮味的氨基酸，是天然的食品添加劑，是我國許可使用的9種增味劑之一[4]，可緩和酸辣苦澀等味道，柔和食品口感，提高食物營養價值，也能用于飲料中，既可以補充氨基酸的含量，也可以利用丙氨酸的堿性來降低酸度，從而調節飲料的口感。郭媛等[5]研究表明，在日常飲食中加入適量的L-丙氨酸可以讓人們更容易接受豆制品和蔬菜汁的口感，降低了令人不舒服的味道，同時也提升了產品的營養價值，擴展了此類飲品的消費市場。添加L-丙氨酸到魚露中能有效減少含硫化合物的相對含量，改善產品風味[6]。L-丙氨酸和DL-丙氨酸可以使酒的味道更加醇正濃厚，增加了酒的甜味，抑制了美拉德反應，還可防止發泡酒老化，并減少酵母氣味等。DL-丙氨酸還可用于改善浸漬品的風味，防止油類及油類食品氧化，提高腌制效果，同時縮短腌制的時間[7]。DL-丙氨酸具有緩沖酸堿、螯合重金屬和抑制其他氨基酸褐化的功能。

1.2 丙氨酸在醫藥領域中的應用

在醫藥領域中，L-丙氨酸作為營養劑和生糖氨基酸的成分之一[5]，可以用來檢測肝臟功能，制作生物化學藥劑等。也可用作術前、術后的營養劑[7]；L-丙氨酸作為一種原料，可用于生產多種藥物，例如作為前體物質合成某些抗癌藥物，用于治療宮頸癌、喉癌等，也可以用于生產索非布韋，治療慢性肝炎感染，及生產依那普利治療高血壓等；此外，血液保存劑中還包含L-丙氨酸，其代謝及豐度與氨基糖苷抗生素耐藥性有關[8]。L-丙氨酸還是維生素B6的重要原料，合成氨基丙醇用來制造氧氟沙星等高效抗菌藥，也可以增強吡啶酮酸等抗菌藥的殺菌效果，增加細胞內活性氧的產生，起到協同抗分枝桿菌的作用，為抵抗結核病做出貢獻[9]。結核分枝桿菌引起的結核病仍然是一個主要的全球衛生問題，結核分枝桿菌的耐藥性和持久性進一步加劇了這種情況。在保健品行業，L-丙氨酸是一種護肝配方成分，可以有效地減少酒精中毒程度，還可以制成預防疲勞的營養品[10]；在生理醫學上研究發現D-丙氨酸能防止機體的脂質受到氧化損害。可以抑制N-亞硝基二甲胺等致癌物質，在腫瘤細胞質中使體內的氨基酸氧化酶異位表達，從而消除細胞內的毒素，可以作為一種抗癌藥物[11]；在制藥方面，D-丙氨酸是抗生素維吉尼亞霉素系列藥物的原料[3]，也是合成二肽阿力甜的重要原料[12]；D-丙氨酸在精神分裂癥、阿爾茲海默癥和腎臟疾病等多種人類疾病中具有相關性，為各種神經和精神疾病以及許多其他疾病的新生物標志物和治療策略鋪平道路[13]。β-丙氨酸合成巴柳氮后可用在治療直腸炎以及結腸炎等腸胃疾病，也可以合成泛酸鈣或帕米磷酸二鈉減輕腫瘤性骨痛和高血鈣癥。

1.3 丙氨酸在日化及其他領域中的應用

L-丙氨酸作為溫和的氨基酸表面活性劑表現出良好的去污、乳化及滲透能力，在護理品中具有美白保濕、延緩衰老等功能，更適用于敏感性肌膚，生物降解性好并且綠色環保；在化妝品中，D-丙氨酸不但有抗菌效果，而且是天然的保濕成分，起到了保持角質層水分的作用[14]。在用于生產新型螯合劑如甲基甘氨酸二乙酸時，L-丙氨酸避免了一些傳統磷酸鹽對生態系統的破壞，可以自然降解，減少了對人類和環境的損害。古戶波等[15]將L-丙氨酸和鳥嘌呤組合作為原料，合成了鳥嘌呤-氨基酸衍生物緩蝕劑，具有新型、綠色和無毒性的特點。β-丙氨酸晶體還可增強大腸桿菌的抑菌活性并用于廢水處理[16]。

2 丙氨酸的合成

2.1 L-丙氨酸的合成

2.1.1 傳統方法制備L-丙氨酸

生產L-丙氨酸的傳統制備方法主要有提取法、蛋白質水解法和化學合成法。提取法可采用酸水解或酶解法，將玉米蛋白或者明膠等L-丙氨酸含量高的原料進行分解，再經過手性拆分可以獲得L-丙氨酸。然而該工藝成本較高，不利于大規模的工業化生產。早期在我國應用蛋白質水解法比較廣，因為原料來源普遍、價格低廉，并且工藝也簡單。但其生產效率低，易造成三廢污染，難以在工業化生產中占有優勢，目前該方法已經被淘汰。化學合成法有3種途徑，可通過溴丙酸、氨水和碳酸氫銨混合作用，經過蒸發、去溴化銨、過濾、脫色等一系列步驟生成丙氨酸；亦可將乙醛和氫氰酸與氨反應制備氨基丙酸鈉，最后采用離子交換法生成終產物；也可通過丙酸氯化法進行合成，但存在產量低、質量差和環境污染等問題，目前基本不采取該方法。

2.1.2 微生物發酵法合成L-丙氨酸

在大腸桿菌中L-丙氨酸和α-酮戊二酸通過谷丙轉氨酶的催化生成丙酮酸和谷氨酸，且此反應為可逆反應，如圖1所示。

圖1 L-丙氨酸和α-酮戊二酸的轉氨反應式Fig.1 The transamination reaction formula of L-alanine and α-ketoglutarate

雖然谷丙轉氨酶可以催化L-丙氨酸的生物合成，但其效率很低。D-乳酸、乙醇和乙酸等經由丙酮酸進一步代謝產生[17]，諸如此類的代謝途徑與L-丙氨酸代謝途徑爭奪碳源，不利于其生物合成，細胞內產生的部分L-丙氨酸通過膜轉運蛋白運輸到胞外，另一部分L-丙氨酸在消旋酶的催化下變成D-丙氨酸，用作細胞壁的生成，ZHANG等[18]通過敲除甲基乙二醛合成酶基因(mgsA)以減少生成乳酸的途徑，敲除分解性丙氨酸外消旋酶基因(dadX)以減少L-丙氨酸到D-丙氨酸的轉化，進而提高L-丙氨酸的產量。通過選擇改善糖酵解途徑以利于丙氨酸生產。結果表明，菌株XZ132在無機鹽培養基中發酵48 h，L-丙氨酸的產率為95%。曹杰[19]研究了以價格低廉的葡萄糖為原料發酵制備L-丙氨酸，將丙氨酸合成的支路代謝基因L-乳酸脫氫酶ldh從枯草芽孢桿菌IBL23染色體上敲除，提升了丙氨酸產率。周麗等[20]探究刪除了支路代謝產物合成途徑，將源于嗜熱脂肪芽孢桿菌的丙氨酸脫氫酶基因alaD取代菌株染色體上的丙氨酸消旋酶基因dadX，以甘油作為唯一碳源進行發酵，促進了L-丙氨酸的合成水平。孫金凱[21]在產酸克雷伯氏菌上敲除了甲基乙二醛合成酶基因mgs，并在此基礎上將丙氨酸脫氫酶基因alaD替換乳酸脫氫酶編碼基因ldh，以葡萄糖為原料，有效提升了丙氨酸的轉化。潘海亮等[22]研究所用的碳源是10%混合糖(5%葡萄糖和5%木糖)，敲除轉運葡萄糖的關鍵基因ptsG以大幅減弱了葡萄糖效應，為以木質纖維素為原料制取丙氨酸奠定了良好的工業應用基礎。王燦等[23]研究通過敲除關鍵基因ptsG以及mglB抑制葡萄糖作用，采用葡萄糖60 g/L、木糖30 g/L、水稻秸稈水解液作為碳源，提高水解液對L-丙氨酸的發酵效果。發酵法生產用到的原料葡萄糖供應充足，價格低廉，但丙氨酸的產量不高，工業化生產效率低。發酵法是當前研究的熱點，隨著技術的不斷發展，其優越性將得到進一步的發展。

2.1.3 酶催化法合成L-丙氨酸

汪芳[24]將來源于德阿昆哈假單胞菌中編碼L-天冬氨酸β-脫羧酶的基因aspD克隆至大腸桿菌BL21(DE3)中，通過誘導表達重組菌，使蛋白的可溶性表達提升。利用定點突變技術改善酶在酸性條件下的酶活力，構建組合突變株，在優化后的條件下進行全細胞轉化，結果表明，突變株N34D/L484M在12 h內摩爾轉化率達99.6%，L-丙氨酸生成速率為4.17 g/(L·h)。發酵轉化27 h時，L-丙氨酸產量為371.05 g/L，摩爾轉化率達到92.3%。于佳印[25]研究篩選到Acinetobacterradioresistens來源L-天冬氨酸β-脫羧酶(ArAsd)并通過分子改造提高ArAsd的酸穩定性。構建一系列突變體，其中N35D、A179E突變體顯示出比較好的酸穩定性。構建了ArAsd-N35D與EcAspA雙酶偶聯重組菌，通過全細胞催化底物富馬酸生成L-丙氨酸達971.26 mmol/L，轉化率為97.3%。通過表1對比微生物發酵法與酶催化法的國內外研究水平，可知該工藝較其他方法具有高效、綠色、環保的特點，但原料價格偏高。

表1 微生物發酵法與酶催化法合成L-丙氨酸的國內外研究水平對比Table 1 Comparison of domestic and foreign research levels on the synthesis of L-alanine by microbial fermentation and enzymatic catalysis

2.2 D-丙氨酸的合成

2.2.1 化學合成法合成D-丙氨酸

不對稱合成法和手性拆分法是化學合成的主要方法。不對稱合成法是直接利用化學原料合成D-丙氨酸，而手性拆分法則是先合成中間產物DL-丙氨酸，再通過光學方法對其進行分離，得到純品的D-丙氨酸[26]。由于該反應所需的手性試劑或金屬絡合物的價格昂貴，且存在諸多不足如反應機制復雜、生產周期長等，限制了這些方法推廣與應用。ZHANG等[27]利用枯草芽孢桿菌HLZ-68固定化細胞不對稱降解DL-丙氨酸生產D-丙氨酸，用聚乙烯醇和海藻酸鈣等不同的化合物對枯草桿菌HLZ-68細胞進行固定化并具有更高的降解活性。采用陽離子交換樹脂可方便地從反應液中提取D-丙氨酸，其化學純度和光學純度分別為99.1%和99.6%。該方法不僅提高了固定化細胞的利用率，而且滿足了工業化生產的要求。王傳磊[28]根據微生物降解機理不對稱性，在一定條件下培養，使菌體Ala-D45產生氨基酸氧化酶，具有強氧化性，氧化DL-丙氨酸中的L-丙氨酸，從而獲得D-丙氨酸。丁兆偉[29]研究獲得了一株能夠迅速徹底降解L-丙氨酸而對D-丙氨酸幾乎不降解的菌株Ala-D45。優化培養條件后通過發酵分析得到：D-丙氨酸的總回收率為67.72%，純度達99.86%。

2.2.2 微生物發酵法合成D-丙氨酸

張學禮等[30]敲除了大腸桿菌XZ-A26的乳酸脫氫酶、乙醇脫氫酶、甲基乙二醛合成酶等支路途徑基因，減少了副產物的積累，并將源于枯草芽孢桿菌的L-丙氨酸脫氫酶基因和丙氨酸消旋酶基因轉化到宿主內，構建獲得工程菌株大腸桿菌XZ-A30，以葡萄糖等糖類為原料進行發酵，產物DL-丙氨酸產量達114.6 g/L，D-丙氨酸產量達57.3 g/L。微生物發酵技術是安全、簡單、應用廣泛的工業化生產方法，但生產菌株的選育難度大、培養周期長及反應能量消耗大，分離技術也有待進一步突破。

2.2.3 生物酶法合成D-丙氨酸

王勝鋒等[14]以乳酸為原料通過兩步法生產D-丙氨酸，先利用乳酸氧化酶催化乳酸生產丙酮酸，然后通過D-氨基酸脫氫酶還原成D-丙氨酸，在此過程中加入輔酶，條件優化后，D-丙氨酸的轉化總摩爾收率能達到64.9%，產品的對映體過量(enantiomeric excess, ee)值達到99.9%。與傳統方法相比，該法制備工藝具有環保、成本低、質量好等特點，適合于工業化生產。張衛衛等[31]利用天冬氨酸消旋酶全細胞催化L-天冬氨酸消旋得到DL-天冬氨酸，先通過離心去除天冬氨酸消旋酶全細胞，經升溫使殘留的天冬氨酸消旋酶滅活，再加入純化后的D-氨基酸轉氨酶酶液，催化D-天冬氨酸和丙酮酸發生轉氨反應得到D-丙氨酸。在優化條件下，D-天冬氨酸轉化率達94%，D-丙氨酸收率為84%，ee值達98%。LI等[32]采用共固定化來自嗜熱共生桿菌的二氨基庚氨酸脫氫酶和來自嗜熱假絲酵母的甲酸脫氫酶催化丙酮酸鈉制備D-丙氨酸。優化固定化和生物轉化條件后，D-丙氨酸平均產率為75.7%，ee值為99.5%。這表明共固定化酶系統是一種很有前途的生物催化劑，可用于丙酮酸的綠色生產。如表2所示，生物酶法合成D-丙氨酸質量品質好，但收率還有提高的空間。

2.3 DL-丙氨酸的合成

2.3.1 化學法合成DL-丙氨酸

化學合成法存在反應過程復雜、工藝周期長、生產成本高及環境污染大等問題。毛建衛等[33]通過研究提出了將多元溶劑循環合成與離子膜分離技術結合的新工藝。在反應的過程中除了生成所需產品DL-α-丙氨酸外還得到了高附加值的氯化銨結晶副產物，再經膜過濾，將反應后的母液回收用作多元溶劑循環利用，母液里含有反應體系所需的催化劑以及沒有反應完全的合成原料，進行新一輪合成反應時，不用再另外添加催化劑，未反應完全的原料可以進行下次反應。利用這種方法合成的產物是混合物，利用新型反饋式離子膜分離技術，獲到DL-丙氨酸產物，并同步獲得副產品。此方法減少了有毒溶劑-甲醇的使用，可極大降低能耗，減少了生產成本，提高了產品質量，基本消除了三廢。

2.3.2 生物酶法合成DL-丙氨酸

生物法合成DL-丙氨酸目前主要以生物酶法催化為主。孫洪露[7]將大腸桿菌K-12的丙氨酸消旋酶Alr基因通過載體質粒pET-28a克隆到大腸桿菌BL21(DE3)中，并表達出重組丙氨酸消旋酶。減壓蒸餾結晶后，可以得到90.6 g的DL-丙氨酸，回收率為90.6%。這種制備DL-丙氨酸的方法產率較低但成本低，簡單易操作，且污染小，可以應用于工業化生產。焦慶才等[34]利用富馬酸為原料，配制成一定濃度的富馬酸氨水溶液，再將含有天冬氨酸-β-脫羧酶、天冬氨酸酶以及丙氨酸消旋酶的菌體細胞或者是表達后3種酶的粗酶液與富馬酸氨水溶液混合，再利用等電點結晶與陰陽離子交換樹脂相結合的方式進行分離，再經過干燥最后得固體DL-丙氨酸31.5 g，結晶母液利用乙醇回收后循環利用，2次結晶共得DL-丙氨酸132 g，收率89.6%。該方案的主要技術創新點是使用多酶偶聯技術生產DL-丙氨酸，具有高生產效率且原材料來源廣、生產工藝操作簡單、酶促時間短和生產成本低。

2.4 β-丙氨酸的合成

2.4.1 化學合成法合成β-丙氨酸

丙烯腈法、β-氨基丙腈法、琥珀酰亞銨降解法存在成本高、污染較嚴重等問題，在工業生產中已較少使用。

2.4.2 微生物發酵法合成β-丙氨酸

雖然微生物發酵是工業化生產β-丙氨酸的一種很有前途的方法，但目前還缺乏高效的微生物細胞，ZOU等[35]通過敲除3個天冬氨酸激酶的基因，來防止天冬氨酸的支路丟失，從而促進β-丙氨酸的合成。以L-天冬氨酸脫氫酶基因代替天冬氨酸氨基轉移酶基因，同時優化啟動子來過表達天冬氨酸脫氫酶基因，增加天冬氨酸的含量，進一步提高了β-丙氨酸的產量。通過高效表達天冬氨酸脫氫酶基因和導入丙酮酸脫羧酶，提高了草酰乙酸的生物合成。陳可泉等[36]構建重組菌株E.coliBL-pET28a-aspC，構建E.coliBL-pET28a-panD葡萄糖代謝缺陷型菌株；選取重組菌株加入發酵培養基中，以葡萄糖和甘油為碳源生產β-丙氨酸。通過在2個細胞中分別表達aspC和panD，利用混合細菌發酵的方法，降低了生產成本，相比于利用E.coliBL-pET28a-panD單一發酵生產，β-丙氨酸的收率提高了40%。

2.4.3 生物酶法合成β-丙氨酸

β-丙氨酸是一種重要的L-天冬氨酸衍生氨基酸，在酶法合成β-丙氨酸過程中，通常以L-天冬氨酸為底物，在L-天冬氨酸-α-脫羧酶催化下，經過脫羧作用生成β-丙氨酸。酶催化法在過去的幾十年里受到越來越多的關注。目前研究較多的天冬氨酸脫羧酶主要來源于大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌和結核分枝桿菌。范文超等[37]通過分子改造得到了一種天冬氨酸脫羧酶的突變體，具有較高的酶活力，能高效催化反應使天冬氨酸脫羧生成β-丙氨酸，之后對反應條件進行了優化，最終將天冬氨酸的底物濃度改良到250 g/L，經過24 h轉化后，轉化率可以達到98.3%以上，具有工業應用前景。QIAN等[38]利用位點飽和和C-末端缺失，產生變異體Q5。變異體Q5與L-天冬氨酸在15 L生物反應器中偶聯，以富馬酸為底物，形成線性級聯反應體系，產率為118.6 g/L β-丙氨酸，產物/催化劑為5.9 g/g，轉化率>99%。結果表明，重塑PAND的質子化構象可以有效地解除機理失活，提高催化穩定性。

3 總結與展望

化學合成法等傳統方法由于存在原料價格高、生產工藝復雜、效率低下、產量低以及環境污染嚴重等問題，工業生產丙氨酸已經逐步淘汰這些方法，取而代之的是微生物發酵法和酶轉化法。從20世紀中期就開始研究發酵法生產丙氨酸，但是由于當時技術水平有限，發酵法存在諸多弊端。進入21世紀后，隨著發酵設備的升級以及生物技術的發展，帶動了發酵法的技術進步，葡萄糖是發酵法制備丙氨酸的原材料，近年來葡萄糖的市場化程度越來越高，供應充足，價格低廉。微生物發酵法不僅提升了產酸率，還促進了提取及分離的水平，使生物發酵法相對其他合成方法具有非常明顯的競爭優勢，開拓了發展前景。但丙氨酸的產量不高，工業化生產效率低。發酵法是目前研究的熱點，隨著技術的進步，發酵法的優勢將會得到進一步發展。酶催化技術是目前工業上應用最為廣泛的丙氨酸合成方法，它的優勢在于采用生物酶作催化劑，反應條件溫和，同時避免了化學催化劑的污染，也大大降低了成本。近幾十年來，隨著對更綠色、可持續化制造需求的增加，生物酶法制備丙氨酸已成為替代傳統化學法生產的有效替代方案。但此過程中酶的用量較大，L-天冬氨酸或富馬酸等原料資源緊張、價格高漲，同時此法生產的效率也較低，所以酶轉化法難以用于工業化生產。若對酶催化法進一步優化，使用物美價廉的原料，利用雙酶法提升表達量及效率，進一步擴大產量應用在工業化生產中，未來在丙氨酸市場中會有非常好的發展前景。