視網膜色素上皮細胞間緊密連接及其在AMD發病過程中的作用研究進展

王巧云, 解來青

0 引言

年齡相關性黃斑變性(age-related macular degeneration, AMD)是一種視網膜的退行性疾病，病變主要累及黃斑區域，進而造成中心視野缺失和視力下降，是全球老年人群不可逆視力損傷的首要原因[1]。根據其典型的臨床和病理特點，AMD可分為干性(非滲出型或萎縮型)AMD和濕性(滲出型或新生血管型)AMD。干性AMD主要表現為眼底散在分布的玻璃膜疣，并逐漸引起黃斑萎縮。濕性AMD主要表現為脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization, CNV)，從而引發眼底出血、滲出，晚期亦可發展為萎縮病灶[2]。在AMD的發展進程中，血-視網膜內、外屏障均有不同程度損壞，其中血-視網膜外屏障(outer blood retinal barrier, oBRB)的破壞發生在疾病晚期[3]。oBRB主要由視網膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium cells, RPECs)、Bruch膜以及脈絡膜毛細血管的內皮細胞構成，其中RPECs間的緊密連接(tight junction, TJ)是確保oBRB屏障功能的最主要部分。在結構上，緊密連接由三個部分組成：(1)整合跨膜蛋白，如閉合蛋白(Occludin)、密封蛋白(Claudin)和連接黏附分子(junctional adhesion molecule, JAM)；(2)外周錨定蛋白，如ZO蛋白家族緊密連接蛋白1(tight junction protein 1, ZO-1)；(3)緊密連接相關調控蛋白[4]。緊密連接蛋白的缺陷在AMD發病進程中發揮著至關重要的作用[5]。目前臨床上對于干性AMD缺乏特效的治療方法，對于濕性AMD主要是將抗血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)藥物注射到玻璃體腔內，以減少CNV的生長和滲出[6]，但該方法存在需重復注射、并最終無法逆轉黃斑區纖維化瘢痕結局的缺點。因此，本文將對緊密連接在oBRB功能的維持、緊密連接蛋白異常與oBRB的破壞在AMD發病過程中的作用等相關研究進行綜述，以期為AMD治療的研究提供新的思路。

1 緊密連接與oBRB

1.1緊密連接與緊密連接蛋白緊密連接屬細胞間連接的一種，后者還包括黏附連接、縫隙連接和橋粒連接。上皮細胞間和內皮細胞間的連接復合體主要由緊密連接構成，緊密連接使相鄰的兩個或兩個以上細胞的細胞膜緊密的連接起來，以便封閉細胞間隙，形成細胞膜內外屏障，如oBRB[7]。在功能上，緊密連接蛋白主要起連接作用，其在肌動蛋白纖維上，形成連接膜和細胞骨架之間的橋梁。緊密連接對溶質和水的擴散形成了屏障，這被稱為屏障功能。此外其對基底外側和頂端質膜之間細胞極性的維持也形成了屏障，這被稱為柵欄功能[8]。在物質運輸和信號傳導方面，緊密連接也發揮了重要作用，以便調節細胞的生長、增殖和分化[9]。生理狀態下，細胞間連接始終保持動態平衡。在連接成熟和穩定過程中，跨膜蛋白的細胞內分布也會發生變化。即使在質膜和細胞質之間形成穩定的接觸并持續循環之后，連接仍處于動態平衡狀態[10]。

1.2RPECs間緊密連接與oBRB 血-視網膜屏障(blood-retinal barrier, BRB)分為血-視網膜內屏障(inner blood-retinal barrier, iBRB)和oBRB[11-12]。iBRB由視網膜毛細血管內皮細胞及包裹內皮細胞的周細胞和Müller細胞構成，Müller細胞通過信號傳遞的方式感知視網膜微環境進而影響視網膜毛細血管內皮細胞的活動。oBRB由RPECs之間的緊密連接、Bruch膜以及脈絡膜毛細血管的內皮細胞構成。視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)位于光感受器(photoreceptor, PR)與Bruch膜之間，將感光的視網膜與能量供應的脈絡膜毛細血管隔開。緊密連接連接相鄰的RPECs，阻止血漿成分和有毒分子進入視網膜，并允許液體和溶質以一定的滲透梯度從脈絡膜血管系統流向視網膜外層[13]。此外，RPE還具有維持散射光的吸收、旁分泌(如分泌VEGF)、視網膜下間隙平衡等重要生理功能。因此，RPE的主動轉運和RPECs間的緊密連接共同維持諸如視網膜-脈絡膜營養物質的過濾和運輸、視網膜代謝廢物的清理和排泄、以及參與對光感受器外段(photoreceptor outer segment, POS)的吞噬作用，進而維持PR的正常生理功能[14]。

1.3緊密連接蛋白與oBRB的關系

1.3.1ZO-1與oBRB的關系ZO蛋白屬膜相關鳥苷酸激酶家族(membrane associated guanylate kinase, MAGUK)，包括ZO-1、ZO-2和ZO-3三個亞型。其中ZO-1是在上皮和內皮細胞中發現的第一個緊密連接蛋白[13]。ZO-1與一些緊密連接跨膜蛋白結合，并與肌動蛋白絲連接，從而維持細胞動力[15]。ZO-1/ZO-1-相關核酸結合蛋白(ZO-1-associated nucleic acid-binding protein, ZONAB)信號通路控制上皮細胞在G1/S期轉變和分化[16]。Georgiadis等[17]研究表明，ZONAB的激活是RPECs中ZO-1表達缺失的主要原因。下調ZO-1后可觀察到RPE單層分子膜的固縮和破裂、POS固有的規則排列變的紊亂，并伴有細胞外間隙的形成，進而造成RPE屏障功能的破壞。Farjood等[18]研究顯示，在人RPE長期培養中，ZO-1定位于根尖和細胞間區域，VEGF主要表達于基底外側，ZO-1的表達水平和VEGF的表達量成反比。在干性AMD的后期，RPECs的凋亡導致其細胞間緊密連接的喪失，ZO-1表達下調，VEGF表達升高，進而促進CNV的形成。在對干性AMD向濕性AMD轉變的病理分析中發現，CNV始于干性AMD的外周邊緣，這也間接證明RPECs間緊密連接的破壞在干性AMD向濕性AMD的轉變中發揮了重要作用。

1.3.2Occludin與oBRB的關系Occludin屬緊密連接相關的Marvel蛋白(TJ-associated Marvel protein, TAMP)家族，是最早發現的與緊密連接相關的跨膜蛋白，其具有四個跨膜結構域[19]。Occludin優先定位于雙細胞緊密連接中，參與細胞黏附和調節細胞旁通透性。其C端與ZO-1和ZO-2相互作用，最后150個氨基酸與肌動蛋白絲相互作用。新近研究發現，Occludin的翻譯后磷酸化狀態影響其在緊密連接中的位置及其對細胞外通透性的調節功能[12]。Occludin的蘇氨酸和絲氨酸磷酸化與緊密連接完整性保持一致，而Occludin的酪氨酸磷酸化會破壞ZO-1和Occludin的結合，進而增加細胞旁通透性。在生理狀態下，Occludin主要通過與ZO-1的相互作用來維持正常的RPECs間緊密連接[20]。Zhang等[21]研究發現，在實驗性糖尿病視網膜病變模型中，oBRB的嚴重損傷是大鼠視網膜水腫的主要因素。促紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)通過下調低氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α, HIF-1α)和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase, JNK)信號通路，進而上調RPECs中ZO-1和occludin的表達，維持oBRB的完整性。在AMD發病過程中也存在Occludin與ZO-1結合體的破壞，Jo等[5]研究提出，細胞內淀粉樣蛋白-β通過活化B細胞的核因子κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa light chain enhancer of activated B cells, NF-κB)的活化，破壞Occludin與ZO-1復合物的完整性，進而促進AMD的疾病進展。Fabian等[22]新近報道，采用高滲和氧化應激破壞Occludin與ZO-1的連接可使脈絡膜微環境中VEGF表達上調，而采用對Occludin與ZO-1連接的保護劑垂體腺苷酸環化酶活化多肽(pituitary adenylate cyclase activated polypeptide, PACAP)后，脈絡膜中VEGF的表達出現下調，進而實驗組小鼠黃斑區CNV的形成得到了有效抑制。上述研究為Occludin蛋白保護劑應用于AMD等新生血管性眼病的治療提供了新的啟示。

1.3.3Claudin與oBRB的關系與Occludin相似，Claudin也有四個跨膜區域(兩個胞外域和兩個胞內域)，其通過C端結構域直接與ZO-1、ZO-2和ZO-3等外周蛋白相互作用。Claudin的第一個胞外區決定跨上皮細胞膜電阻(trans epithellal electric resistance, TEER)和胞外電荷選擇性，從而維持細胞間的通透性[13]。上皮細胞間的緊密連接可維持溶質和水在上皮細胞間的跨上皮運動，即細胞旁滲透性。細胞旁滲透性有孔隙途徑和滲漏途徑兩種途徑，前者介導小離子和溶質運動，后者介導大溶質運動[19]。Claudin蛋白形成基本的細胞旁滲透性屏障，并通過孔隙途徑介導小離子和溶質運動，對細胞旁選擇性和通透性發揮著獨特的功能。Claudin有多種分型，在不同物種和不同組織表型各異。其中Claudin-19在RPE中表達且含量豐富，是目前最主要的Claudin[23]。Wang等[24]近期研究表明，突變Claudin-19可影響RPE發育的各個階段，并對視網膜分化存在重要影響。

1.3.4JAM與oBRB的關系JAM是免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily, IgSF)中CTX亞家族的成員，包括JAM-A、JAM-B、JAM-C和JAM4[25]。已知JAM可與諸多蛋白質相互作用，并通過靶向緊密連接相關的蛋白質來調節緊密連接的功能。JAM由一個跨膜區和一個包含兩個Ig樣基序的胞外區組成。C端結構域參與緊密連接支架蛋白的相互作用，這對維持緊密連接的正常功能尤為重要。JAM-A可與Occludin、ZO-1共定位，進而維持正常的緊密連接[13]。Jia等[26]研究表明，JAM-C在成年小鼠視網膜和脈絡膜中大量表達，在體外培養的RPECs和PR細胞中亦有所表達。過氧化氫(H2O2)誘導的氧化應激可下調JAM-C的表達，擾亂其膜定位，進而影響oBRB的正常功能。JAM-C在視網膜毛細血管內皮細胞中過表達或敲除分別降低或增加胞質Ca2+濃度，進而影響JAM-C的動態易位，造成BRB的功能障礙。調節JAM-C活性對BRB功能障礙相關眼病的治療具有潛在的治療價值[27]。

2 緊密連接及oBRB破壞與AMD

AMD的相關研究提示，AMD的發生及進展與RPECs間緊密連接的破壞密切相關。在氧化應激、缺氧、炎癥等病理條件下，RPE退化，視錐細胞凋亡，最終形成以黃斑區地圖樣萎縮為特征的干性AMD的晚期形態。在RPE的退化過程中，RPECs間緊密連接破壞(早于或晚于RPE退化，有待進一步研究)、緊密連接相關蛋白如ZO-1、Occludin、Claudin、JAM及VEGF的表達和分布發生異常，oBRB正常生理屏障功能遭到破壞，CNV形成并跨越RPE侵入神經上皮層下間隙，進而促進AMD由干性轉變為濕性，局部微環境的改變會引起RPECs間緊密連接的進一步破壞，從而導致黃斑功能的嚴重損壞[3]。

RPECs的微絨毛從其頂面延伸至視桿細胞和視錐細胞的外節，從而構成RPECs和PR細胞之間獨特的功能單元，這被認為是維持視覺功能的關鍵[28]。在干性AMD中，中央凹周圍的RPE首先退化，隨著病程進展，RPE退化逐漸向中央凹發展，最終導致中央凹視錐細胞凋亡和中心視力喪失。每個中央凹RPECs都支持其對應部位視錐細胞的營養代謝。最低限度的RPE再生，甚至維持現有的RPE而不進一步退化，可保證足夠的PR存活，從而保證患者的中心視力和生活質量[29]。RPE變性、玻璃膜疣形成或與衰老相關的凋亡可導致RPECs間緊密連接的丟失，進而引起RPE的上述功能發生障礙[30]。在濕性AMD中，CNV形成是其主要病理機制，VEGF是CNV形成的始動因素。VEGF除脈絡膜自分泌外[31]，亦可由健康RPECs的基底外側分泌。生理條件下，適度VEGF的分泌參與脈絡膜血管的調節[32]，而RPE退化引起的RPECs間的緊密連接破壞可誘導VEGF的過度表達，從而引發CNV，最終造成AMD由干性轉變為濕性[33]。Warden等[34]通過對TEER和ZO-1的免疫熒光檢測發現，100～500μmol/L濃度的甘氨膽酸和甘氨熊脫氧膽酸可有效保護RPECs間緊密連接免受氧化應激損傷，且可抑制VEGF介導的CNV形成及其遷移，為濕性AMD的治療開辟了新的方向。上述研究表明，RPE破壞可引起緊密連接衰減或分布改變，進而通過VEGF上調改變AMD的進程[35]，而阻止或減緩RPECs間緊密連接的破壞，對阻止AMD的進展具有重要意義。

3 總結與展望

AMD引發的CNV部分由干性AMD期RPE的退化導致VEGF的過度表達所介導，探索oBRB屏障破壞的時期和機制對阻斷VEGF過度表達有一定的指導意義。多種遺傳因素、氧化應激、脂質代謝、炎癥、外傷和衰老相關的凋亡等可造成黃斑部視網膜缺血缺氧，大量脂質代謝產物不能及時被清理從而形成以玻璃膜疣為特征的干性AMD的典型病理改變。當病情進展時，RPECs間緊密連接被破壞，VEGF過表達，CNV形成，CNV突破oBRB并向神經視網膜下間隙生長，從而使疾病進入到以黃斑區CNV形成和出血為特征的濕性AMD的更加嚴重的階段。RPE相關緊密連接蛋白在濕性AMD的發病過程中的具體作用機制有待進一步深入的探討。盡管已證實oBRB細胞間緊密連接缺陷與AMD引發的CNV有關，但緊密連接缺陷最初發生的時間點、始動因素及緊密連接相關蛋白改變的上、下游調控通路在AMD發生發展過程中的作用仍存諸多疑問。深入探究緊密連接缺陷與AMD的關系及其機制或許可為AMD相關新生血管性眼病的治療提供新的思路。