高效液相色譜—串聯質譜法測定豬可食性組織中烯丙孕素殘留

倪香艷 孫念霞 于寒冰 方 芳 孫志文

(1. 北京市農產品質量安全中心,北京 102629；2. 安徽中醫藥大學,安徽 合肥 230012)

烯丙孕素是一種人工合成的甾類促孕孕酮[1-2]。臨床上歐盟和美國已批準將烯丙孕素用于對豬和馬的同期發情的調控[3]，其作用機理是通過與黃體酮的受體結合，抑制機體內促性腺相關激素的生成[4]，降低其在血漿中的濃度，進而調控母畜發情周期[5]。非洲豬瘟背景下，種豬的繁殖性能是育種成功的關鍵所在，作為人工合成的甾類促孕孕酮的烯丙孕素在中國母豬批次化生產過程中，也成為應用最為廣泛的外源性孕激素之一[5-6]。但動物試驗表明孕激素會增加死胎率，且有致畸作用[7]，人體長期攝入烯丙孕素藥物超標的動物產品會破壞機體內激素平衡，引起癌變，還會導致嬰幼兒身體發育異常[8-9]。為避免烯丙孕素在動物可食性組織中的殘留，農業農村部規定烯丙孕素在豬肌肉、肝臟、脂肪中的最高殘留限量(試行)分別為1，2，4 μg/kg。

目前有關孕激素等激素類藥物殘留的檢測方法有液相色譜法[9-10]、氣相色譜—串聯質譜法[11]、液相色譜—串聯質譜法[12-13]等。液相色譜法的抗干擾能力較差、靈敏度低[10]；氣相色譜法樣品需衍生化，不適用于激素類等揮發性較低的藥物檢測[11]；高效液相色譜—串聯質譜方法具有特異性強、靈敏度高等優點[13]，已成為獸藥殘留痕量藥物檢測的發展趨勢。目前國內外有關烯丙孕素藥物的研究主要集中于其對母豬發情性能的影響機理等方面[3]，對其在動物體內的殘留檢測關注度較少且僅限于肌肉、飼料、肝臟等單一組織[3,14]，未見有肌肉、肝臟、脂肪等多個靶組織同時檢測的多殘留分析方法；部分檢測方法存在前處理過程中未進行酶解導致定量不準確、提取液未凈化[14]導致儀器污染等問題。研究擬建立一種豬肌肉、肝臟、脂肪中烯丙孕素藥物殘留檢測的高效液相色譜—串聯質譜方法，采用多種水解酶進行酶解、乙腈提取豬組織中殘留的烯丙孕素，旨在為豬可食性組織中烯丙孕素殘留分析檢測提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

烯丙孕素標準品：純度≥98.0%，德國Dr. Ehrenstorfer 公司；

β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶：>10 000 U/mL，美國Sigma公司；

乙腈、甲酸：質譜級，德國Merck公司；

PRiME HLB固相萃取柱：200 mg，6 mL，美國Waters公司；

乙酸鈉、氯化鈉：分析純，北京化工廠。

1.1.2 主要儀器設備

高效液相色譜—串聯質譜儀：Waters Xevo TQ-S型，配備MassLynx V4.1軟件處理系統，美國Waters公司；

電子天平：BSA6202S型，上海諾萱科學儀器有限公司；

高速冷凍離心機：CR30NX型，德國Eppendorf公司；

氮吹儀：TTL-DCII型，上海標卓科技儀器有限公司；

旋渦振蕩器：Vortex 3000 Elite型，維根技術北京有限公司。

波紋管作為一種新型強化換熱技術，在各個領域中有廣泛的應用。采用Fluent模擬了3種不同波形度的波紋管流動，從速度分布、壓力分布、渦結構3個方面研究波紋管的流動特性，并與光滑管模擬結果進行對比，得出如下結論：

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理 稱取勻漿后豬肌肉、肝臟、脂肪樣品(2.00±0.01) g，依次加入8 mL乙酸鈉緩沖溶液(0.2 mol/L，pH 5.2)、20 μLβ-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶，渦旋混勻2 min，55 ℃振蕩酶解2 h。分別加入3 g 氯化鈉、10 mL乙腈溶液，渦旋混勻10 min，8 000 r/min離心5 min。上清液于-20 ℃冷凍除脂20 min，冷凍后提取液于-4 ℃、8 000 r/min離心5 min，棄去脂肪層。取5 mL提取液直接過PRiME HLB固相萃取柱，洗脫液直接收集于離心管中，45 ℃氮吹至干，加入0.5 mL 20%乙腈水溶液溶解，上清液過0.22 μm濾膜，凈化后復溶液供儀器檢測分析。

1.2.2 液相色譜條件 色譜柱為Waters UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm)，填料粒徑1.7 μm；流動相A為乙腈溶液，流動相B為0.1%甲酸水溶液，按表1進行梯度洗脫；流速0.3 mL/min；上樣體積10 μL；柱溫30 ℃。

表1 烯丙孕素高效液相色譜梯度洗脫條件

1.2.3 質譜條件 參照李建等[14]的方法。電噴霧正離子源；MRM質譜多反應監測信號采集方式；毛細管電離電壓3.00 kV；源溫度150 ℃；脫溶劑溫度400 ℃；錐孔氣流速150 L/h；脫溶劑氣流速700 L/h。

1.2.4 標準曲線的制備 空白陰性樣品按1.2.1處理得空白樣品提取液，稀釋標準品，得到系列基質匹配標準溶液，以待測藥物濃度作為橫坐標，對應的藥物峰面積作為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.5 檢測限和定量限 在空白陰性試驗樣品中添加待測藥物，按1.2.1處理后進行分析。按照待測藥物色譜峰信號響應的信噪比S/N>3確定檢測限；S/N>10確定定量限。

1.2.6 準確度和精密度 在空白陰性試驗樣品中添加待測藥物，對試驗方法開展方法學考察。空白樣品中添加水平為1.0，2.0，10.0 μg/kg藥物，每個藥物水平設5個重復，連續測定3 d，根據檢測結果計算待測藥物的回收率、日內變異系數和日間變異系數等。

2 結果與分析

2.1 前處理條件優化

2.1.1 提取條件 烯丙孕素藥物多以與硫酸和葡萄糖醛酸結合形成結合型的軛合物形態存在[15]。試驗采用β-葡萄糖醛苷酸酶/芳基硫酸酯酶進行酶解，藥物檢測過程中將其結合態水解成游離形式的化合物進行測定。考慮到提取效率和安全等因素，選用乙腈作為前處理提取試劑。由圖1可知，10，15 mL 乙腈對烯丙孕素提取的回收率接近且高于5 mL乙腈的，因此采用10 mL乙腈提取液對藥物進行提取。

圖1 乙腈提取體積對藥物回收率的影響Figure 1 Effects on sample recovery of acetonitrile extraction volume

2.1.2 凈化方式 待測樣品中的雜質主要有蛋白質、脂類物質和一些小分子的極性物質[16]。蛋白質等大分子雜質、小分子極性物質等在有機溶劑提取藥物過程中可以有效去除，脂類等大分子物質可以通過正己烷去除或者在低溫冷凍下除脂。而烯丙孕素藥物的極性較小，在正己烷中會有一定的溶解性[17]，因此采用低溫冷凍去除脂類，使提取液的凈化效果能夠滿足要求[18]。

由圖2可知，HLB、C18固相萃取柱需活化，過程較繁瑣且對待測物質吸附強，藥物損失較大；PRiME HLB固相萃取柱處理樣品方便、簡單，不需要活化固相萃取柱，提取液直接流經固相萃取柱后進行濃縮、復溶即可檢測，極大提升了樣品前處理效率。

圖2 凈化方式對回收率的影響Figure 2 Effect on recovery of purification methods

2.2 色譜條件優化

激素類藥物分離多采用C18反相色譜柱[19-20]，研究選用柱長為50 mm，柱內徑為2.1 mm，粒度為1.7 μm的色譜柱時，色譜柱對待測組分與干擾雜質間的分離效果能滿足檢測要求。由圖3可知，流動相采用乙腈-0.1%甲酸水進行梯度洗脫時，色譜峰型好，信號響應高，烯丙孕素能有效分離。

a1、a2為子離子MRM色譜圖；a3為總離子MRM色譜圖

2.3 質譜條件優化

試驗表明，在負離子模式下直接進樣進行測定，采集到的烯丙孕素母離子信號響應值較低；在正離子模式下直接進樣進行測定，烯丙孕素母離子信號響應良好。故試驗在酸性條件下進行，采用正離子模式電離檢測待測藥物。由表2可知，全掃描得到的準分子離子峰([M+H]+)為311.2。調節毛細管電壓，使其豐度最大，進行二級質譜分析，優化毛細管電壓、脫溶劑氣流速及碰撞能量，進行子離子掃描，選擇響應最高的兩個離子碎片為待測藥物定量離子和定性離子，最佳質譜參數條件：定量離子對311.2>227.2，錐孔電壓22 V，碰撞電壓24 V；定性離子對311.2>269.2，錐孔電壓22 V，碰撞電壓18 V。

2.4 方法學考察

2.4.1 基質效應 試驗表明，烯丙孕素在豬可食用性組織中存在較強的基質抑制效應，故采用基質匹配標準溶液來消除基質效應。

2.4.2 線性范圍 由表2可知，烯丙孕素在1～50 μg/L的質量濃度范圍內線性良好，相關系數R2在0.99以上。

表2 不同基質烯丙孕素線性方程

2.4.3 檢測方法靈敏度 由圖4可知，在對應的保留時間內，空白試樣中基質對待測藥物無明顯干擾。

當豬可食性組織中烯丙孕素添加量為0.5，1.0 μg/kg時，信噪比>3，當烯丙孕素添加量為1.0 μg/kg時，信噪比>10。因此，烯丙孕素檢測限(LOD)為0.5 μg/kg，定量限(LOQ)為1.0 μg/kg。

b1、b2為子離子MRM色譜圖;b3為總離子MRM色譜圖

2.4.4 檢測方法準確度和精密度 選取陰性肌肉、肝臟、脂肪樣品進行添加回收試驗，以肝臟組織為例，烯丙孕素添加離子色譜圖如圖5所示，方法學考察該方法的準確度和精密度。由表3可知，3個添加水平下，平均回收率為68.9%～87.4%；日內變異系數為0.8%～7.1%，日間變異系數為2.5%～11.6%，方法回收率及精密度滿足殘留檢測要求。

表3 烯丙孕素不同添加量豬可食性組織中的回收率和變異系數

c1、c2、d1、d2、e1、e2為子離子MRM色譜圖;c3、d3、e3為總離子MRM色譜圖

3 結論

試驗建立了一種快速檢測豬肌肉、肝臟、脂肪多種可食性組織中烯丙孕素藥物殘留檢測的高效液相色譜—串聯質譜方法。結果表明，試驗方法的前處理過程快速準確，凈化效果顯著且對儀器無污染。該方法線性關系良好，靈敏度高，重現性好，適用于豬肌肉、肝臟、脂肪多種組織中烯丙孕素殘留批量快速檢測。但試驗未對更多的樣品中烯丙孕素殘留量進行測定，今后可以進一步對各個環節中樣品進行藥物含量測定和分析，有利于今后開展畜禽產品中孕激素的風險評估數據積累。