叢枝菌根真菌接種對白車軸草耐鹽性的影響

趙艷蘭，曾鑫奕，弓晉超，李香君，李旭旭，劉珊，張新全，周冀瓊

（四川農業大學草業科技學院，四川 成都 611130）

土壤鹽漬化已成為我國農業可持續發展的限制因素之一［1］。當土壤鹽含量累積超過0.3%時，農作物的正常生長發育就會受到影響，導致作物低產或不能生長［2］。我國鹽漬土壤范圍廣，面積約9.9133×107hm2，占世界鹽漬土面積的10%［3］，在土壤中存在各種鹽類，其中氯化鈉（NaCl）是最普遍的一種［4］。近年來，全球氣候變化劇烈，人類活動頻繁，耕地鹽漬化面積日益增長，加劇了耕地資源緊缺，因此，鹽漬土的改良與合理利用成為亟須解決的科學問題［5-6］。

種植耐鹽植物，作為一種重要的改良技術可提高鹽漬土的生產能力。白車軸草（Trifolium repens）是一種常見的栽培豆科牧草，營養豐富，觀賞價值高，可作為牧草栽培、城市綠化、堤岸防護以及藥材等［6］。但白車軸草耐鹽性差，這在一定程度上限制了其在鹽漬土壤上的栽種應用［6-7］。

叢枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）在土壤中廣泛存在，能夠在各種各樣的生態環境中生長，與世界上大多數的植物形成互惠共生結構［8-9］，AMF 進入植物根皮層細胞后侵染植物形成叢枝菌根［10-11］，根外菌絲體不斷擴大植物根系養分吸收范圍，增加養分的吸收效率［12］，減輕因鹽害造成的損傷，提高植物耐鹽性，對植物的生長有促進作用［13-14］。

通過接種AMF 可以提高不同寄主植物的耐鹽能力［15］，與非鹽生植物相比，AMF 和鹽生植物具有更高效的共生關系［16］。利用叢植菌根真菌提高植物耐鹽性已成為改良鹽漬土綠色高效的生物方法之一［2］。研究發現，AMF 主要通過3 個途徑提高植物耐鹽性：1）通過輔助植物細胞調節體內離子平衡，使細胞內以及細胞間的離子濃度維持在適當的水平［17］；2）通過調節植物體內滲透平衡，增加滲透調節物質含量，緩解鹽害對植物造成的缺水損傷，維持植物體內正常生理生化過程［18-19］；3）通過調節植物抗氧化過程，增強抗氧化能力，降低功能性損害，抵御鹽害對植物組織造成的損傷［20-21］。AMF 在促進植物對土壤養分吸收的同時，還能提高土壤微生物的活性，改良鹽漬土質量［22］。不少研究證明，AMF 對水果、蔬菜、作物、牧草等［1］具有緩解鹽脅迫的作用，但也有一些研究報道，接種AMF 對植物耐鹽性并沒有顯著影響。如Poss 等［23］的研究表明，在鹽脅迫條件下，接種了AMF 的洋蔥（Allium cepa）在不同水平的磷含量條件下，并不總是促進洋蔥的生長發育，在施磷量水平為0.8 和1.6 mol·L-1時，接種與未接種AMF 的洋蔥干重沒有顯著差異，甚至個別未接菌植株干重高于接菌植株［11］。因此，接種AMF 對不同植物或物種的耐鹽性影響尚存爭議。本試驗擬通過溫室模擬試驗，研究在鹽脅迫條件下，接種AMF 對拉丁諾白車軸草生長、抗性機能及生理調節能力的影響，以期提高白車軸草生產性能，為菌根技術的改良及其在鹽漬地綠化中的應用提供論據。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

盆栽試驗于2019年5-9 月在四川農業大學成都校區日光溫室大棚中進行。采用雙因素試驗設計，因素1 為AMF 接種，包括兩個水平：接種AMF 和不接種AMF；因素2 為鹽脅迫，包括兩個水平：鹽脅迫和無鹽脅迫。共有4 個處理，分別為：CK（不接種AMF，無鹽脅迫處理）；M（接種AMF，無鹽脅迫處理）；S（不接種AMF，150 mmol·L-1NaCl 脅迫處理）；MS（接種AMF，150 mmol·L-1NaCl 脅迫處理）。每個處理重復3 次，共12 盆。

1.2 試驗方法

1.2.1 供試草種 拉丁諾白車軸草，購買于四川百綠時代園林綠化有限公司。

1.2.2 育苗 2019年5 月20 日進行白車軸草育苗。選取均勻、飽滿、無病蟲害的白車軸草草種，用75%的酒精浸泡2 min，蒸餾水沖洗3～5 遍，在滅菌的蛭石上發芽，每隔一天澆水一次［24］。

1.2.3 土壤基質準備 試驗土壤采集于四川農業大學教學科研園區，該地年降水量1012 mm，年日照時數1161 h，年均溫15.9 ℃，無霜期238 d，屬于亞熱帶濕潤季風氣候［24］。主要種植的有白車軸草，紅三葉（Trifolium pratense），鴨茅（Dactylis glomerata）等多年生豆禾牧草。將原位土與河砂以3∶1 的比例混合均勻，過2 mm 網篩，去除石頭和植物殘根，放入121 ℃高壓蒸汽滅菌鍋滅菌2 h，冷卻備用［25］。

1.2.4 接種AMF 用未經滅菌的原位土砂混合基質作為接種菌劑。經測定，每20 g 基質包括有124 個AMF孢子，滿足接種要求。經高通量測序，原位AMF 菌劑中包括根孢囊霉屬（Rhizophagus）和內養囊霉屬（Entrophospora）等多種AMF 菌種，可與白車軸草建立共生關系［24］。將種苗移栽到圓形塑料花盆中。用75%的酒精擦洗塑料花盆（18.0 cm×21.5 cm）并晾干，保證其無菌潔凈。用未滅菌的土砂混合基質作為AMF 接種處理；用高壓滅菌后土砂混合基質作為不接菌處理，并加入100 mL 除去AMF 的土壤微生物群落濾液。該濾液的提取方法為：將水和未滅菌土壤以2∶1 的比例混合并充分攪拌，然后過25 μm 的網篩，研究表明，AMF 的孢子體積大于25 μm，但細菌等其他微生物的體積小于25 μm［26］，因此得到的濾液為不含AMF 的土壤濾液。為保持一致，在每盆接種AMF 的處理中加入100 mL 的無菌水。

1.2.5 種苗移栽 種子萌芽25 d 后，將幼苗移栽。每盆移栽15 株長勢相同的幼苗，移栽時將各幼苗分布均勻。移栽后于大棚內進行培育，白天溫度為（25±1）℃，夜間溫度為（15±1）℃。移栽一周后，長勢不好的幼苗用長勢良好的幼苗進行替換。移栽一個月后每周用Hoagland 培養液補充營養。Hoagland 培養液配方：2.5 mmol·L-1Ca（NO3）2、2.5 mmol·L-1KNO3、1 mmol·L-1MgSO4、0.5 mmol·L-1（NH4）H2PO4、0.1 mmol·L-1EDTA-FeNa、0.2 μmol·L-1CuSO4、1 μmol·L-1ZnSO4、20 μmol·L-1H3BO3、0.005 μmol·L-1（NH4）6Mo27O4和1 μmol·L-1MnSO4［27］。

1.2.6 鹽脅迫處理 幼苗生長72 d 時，進行鹽脅迫處理。有研究表明，低濃度的NaCl 鹽溶液對白車軸草生長具有促進作用，而大于40 mmol·L-1的鹽溶液會抑制其生長，鹽濃度越高，抑制作用越顯著［28-29］。因此本研究用NaCl 配制150 mmol·L-1的鹽溶液，對白車軸草進行鹽脅迫處理。連續7 d，每天澆50 mL 溶液進行鹽脅迫，未脅迫處理澆相同體積的蒸餾水。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 白車軸草基本生長性能 待鹽脅迫處理15 d 后收獲植株，收獲前對植物株高進行測量，收獲后于105 ℃殺青30 min，然后于65 ℃烘干48 h 至恒重，用電子天平測定白車軸草干重［27］。

1.3.2 葉片相對含水量（relative water content，RWC） 采用烘干法［30］：白車軸草植株收獲后，每組處理選取長勢一致的白車軸草葉片，剪取約0.1 g 的新鮮葉片，稱取鮮重Wf，用普通吸水紙包好，浸入蒸餾水中，避光靜置24 h 后取出擦干表面水分稱重，記為白車軸草葉片飽和重量（Wt）；然后將葉片烘干至恒重，記為白車軸草葉片干重（Wd）。可得RWC=。

1.3.3 葉綠素熒光的測定（PSⅡ最大光能轉換效率Fv/Fm） 采用葉綠素熒光系統（Pocket PEA）測定葉綠素熒光參數F0、Fm：測定前對葉片進行30 min 暗處理，先打開測量光測葉片的最小熒光F0，再打開飽和脈沖光測最大熒光Fm［32］，計算可變熒光Fv=Fm-Fo［33］。

1.3.4 丙二醛（malondialdehyde，MDA）及電導率（electrolyte leakage，EL） 丙二醛采用硫代巴比妥酸法測定［34］：稱取0.4 g 新鮮植物樣品，將組織放入液氮研磨破碎，然后加入磷酸緩沖液在冰上充分研磨，轉入離心管中，離心后用上清液測定丙二醛含量。植物細胞膜透性通常用相對電導率［35］（EL）來表示：剪取白車軸草新鮮潔凈葉片0.1 g，用紙包好浸沒在裝有蒸餾水的試管中，放置24 h 測定初電導率S1。在水浴鍋中煮沸直到植物組織完全被殺死后冷卻至室溫，測定終電導率S2。相對電導率為。

1.3.5 可溶性糖（soluble sugar，SS）和游離脯氨酸（free proline，Pro） 可溶性糖含量采用蒽酮乙酸乙酯比色法測定［36］：稱取植物樣品0.3 g，加入研缽中，加入蒸餾水和石英砂，研磨后轉入試管，放入沸水中水浴，過濾定容，加入蒸餾水，蒽酮和濃硫酸后，在波長620 nm 處比色。采用酸性茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量［31］：剪取白車軸草新鮮潔凈葉片0.2 g，加入3%的磺基水楊酸溶液5 mL，沸水浴10 min。提取2 mL 上清液，再分別加入2 mL 冰醋酸和2 mL 酸性茚三酮溶液，煮至沸騰30 min。待其冷卻，加入4 mL 甲苯溶液，充分振蕩30 s，靜止片刻后用吸管吸取上層液體至比色杯中，在520 nm 波長處進行比色。

1.4 數據分析與處理

采用Excel 2010 對數據進行統計；用SPSS 24.0 進行方差分析和顯著性檢驗（P＜0.05）。分析接種AMF、鹽脅迫對白車軸草生長及生理指標相對含水量、相對電導率、PSⅡ最大光能轉換效率、可溶性糖、游離脯氨酸、丙二醛含量的影響。用Sigmaplot 12.0 進行繪圖，用Canoco 5 進行主成分分析。

2 結果與分析

接種AMF 和鹽脅迫均不同程度地對白車軸草的株高、相對電導率、PSⅡ最大光能轉換效率、相對含水量、可溶性糖和游離脯氨酸含量產生了顯著影響，但二者的交互作用對所有測定指標均無顯著影響（表1）。

表1 叢枝菌根真菌及鹽脅迫對白車軸草的主要形態和生理指標的方差分析Table 1 Analysis of variance of main morphological and physiological indicators of T.repens by AMF and salt stress

2.1 鹽脅迫下AMF 對白車軸草生長情況的影響

白車軸草在鹽漬土壤中生長受阻，而接種AMF可緩解鹽脅迫造成的影響（表2）。與對照相比，鹽脅迫S 處理下白車軸草株高和干重均顯著降低，分別下降了49.93%和51.39%，AMF 的接種緩解了鹽脅迫毒害作用，白車軸草生長指標均顯著提高，株高提高了84.73%，干重增加了5.15 倍。在未脅迫處理下，接種AMF 后白車軸草株高和干重相比對照分別提高了34.85%和2.14 倍。

表2 鹽脅迫下AMF 對白車軸草生長情況的影響Table 2 Effects of AMF on the growth of T. repens under salt stress

2.2 鹽脅迫下AMF 對白車軸草葉片丙二醛含量和相對電導率的影響

鹽脅迫顯著影響了白車軸草的丙二醛含量和相對電導率（P＜0.05），接種AMF 顯著影響了相對電導率（P＜0.001）（表1）。與CK 相比，鹽脅迫S 處理下，丙二醛含量提高了67.84%，相對電導率提高了35.62%，接種AMF 后，丙二醛和相對電導率分別降低了21.60%和29.25%。未脅迫處理下，與CK 相比，接種AMF 丙二醛和相對電導率分別降低了16.96%和33.15%（圖1）。

圖1 鹽脅迫下AMF 對白車軸草葉片丙二醛含量和相對電導率的影響Fig.1 Effects of AMF on malondialdehyde content and relative electrolyte leakage of T. repens leaves under salt stress不同小寫字母代表不同處理間差異顯著（P＜0.05），下同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level，the same below.

2.3 鹽脅迫下AMF 對白車軸草PSⅡ最大光能轉換效率和相對含水量的影響

由表1 可知，鹽脅迫顯著影響了PSⅡ最大光能轉換效率和相對含水量（P＜0.05），接種AMF 極顯著影響了PSⅡ最大光能轉換效率（P=0.001）。與CK 相比，在鹽脅迫處理下，PSⅡ最大光能轉換效率增加了7.14%，相對含水量降低了7.46%，接種AMF 后，PSⅡ最大光能轉換效率增加了5.53%，相對含水量增加了5.33%。未脅迫處理下，與CK 相比，接種AMF 后，PS Ⅱ最大光能轉換效率增加了9.34%，相對含水量增加了2.26%（圖2）。

圖2 鹽脅迫下AMF 對白車軸草PSⅡ最大光能轉換效率和相對含水量的影響Fig.2 Effect of AMF on maximal photochemical efficiency of PSⅡand relative water content of T. repens under salt stress

2.4 鹽脅迫下AMF 對白車軸草滲透調節物質的影響

鹽脅迫和AMF 接種對白車軸草的滲透調節物質脯氨酸和可溶性糖含量都有顯著影響。與CK 相比，在鹽脅迫處理下，可溶性糖含量提高了33.51%，游離脯氨酸含量顯著增加了79.83%。接種AMF 后，可溶性糖含量和游離脯氨酸含量更大，分別增加了32.03%和9.42%。未脅迫處理下，與CK 相比，接種AMF，可溶性糖和游離脯氨酸含量分別增加了24.06%和38.25%（圖3）。

圖3 鹽脅迫下AMF 對白車軸草可溶性糖和游離脯氨酸的影響Fig.3 Effect of AMF on soluble sugar and free proline of T. repens under salt stress

2.5 鹽脅迫下AMF 對白車軸草各變量的主成分分析

通過主成分分析檢驗白車軸草在鹽脅迫下接種AMF 對各變量的影響。第1 主成分和第2 主成分分別解釋了所有變量變異比率的82.22%和12.07%。本研究發現，在坐標軸1 中均占有較高載荷（載荷＞|0.5|）的變量主要有株高，干重，丙二醛，相對電導率和相對含水量，在坐標軸2 中占有較高載荷的變量主要有PSⅡ最大光能轉換效率Fv/Fm，可溶性糖和游離脯氨酸。從結果可知，株高和相對含水量存在正相關關系，PSⅡ最大光能轉換效率Fv/Fm和可溶性糖存在正相關關系。接種AMF 對植物株高和相對含水量具有重要影響，鹽脅迫對相對電導率的影響最大。鹽脅迫后接種AMF 對PSⅡ最大光能轉換效率Fv/Fm和可溶性糖含量不同的處理分別分布在不同的象限，說明不同的處理之間存在顯著差異（表3 和圖4）。

圖4 鹽脅迫下接種AMF 對白車軸草所有變量影響的主成分分析Fig. 4 Principal component analyses（PCA）of the effect of T. repens under salt stress inoculation with AMF

表3 PCA 中各變量的載荷Table 3 Variable scores values from PCA

3 討論

許多研究證明，鹽脅迫會抑制植物生長發育，使其 生 理 生 化 過 程 紊 亂［37-39］。楊 宏 偉 等［40］在 鹽 脅 迫（NaCl）對藜麥（Chenopodium quinoa）種子萌發和幼苗生理特性影響的研究中發現，高濃度氯化鈉使植物葉片含水量，脯氨酸，丙二醛和相對電導率等降低，本研究結果與此相符合。在本試驗中，鹽脅迫下植物株高和生物量顯著降低，這說明鹽脅迫對白車軸草的生長發育起到了抑制作用，但植物形態變化相對于生理變化具有滯后性。當植物細胞在遭受鹽漬環境損傷時，細胞半透膜正常結構和功能遭到破壞，內容物質大量外滲，導致相對電導率增高、膜脂過氧化物丙二醛含量大量累積，從而干擾細胞的正常生命活動。土壤中鹽濃度的增加，也會導致植物外部的滲透壓降低，植物為了維持細胞滲透壓平衡，通過積累滲透調節物質，減少自身的水分流失［41］。因此，為了抵抗鹽害，白車軸草通過積累游離脯氨酸和可溶性糖，維持滲透平衡，體現出一定的抗鹽性。鹽脅迫在影響植物滲透壓的同時，還會通過影響植物的其他信號通路來影響細胞的生長，導致生長發育速度滯緩，植株萎蔫甚至死亡［42］。

接種AMF，可提高鹽漬土質量，改善宿主植物的生長環境，同時加快植物吸收生長所必需的營養元素，重新建立植物體內新的離子平衡，減少鹽脅迫的不利影響，提高植物耐鹽性［3］。李麗麗［31］的研究結果表明，接種AMF 增加了鹽堿脅迫下的白車軸草的個體生物量，蛋白質含量和光合速率等指標，說明接種AMF 提高了白車軸草的耐鹽能力，本研究結果與此一致。本試驗接種AMF 真菌后，白車軸草的株高和干重都得到了顯著提升。研究表明，AMF 也可能為宿主植物提供生長因子和激素，來改善植物的生長［43］。這驗證了AMF 與白車軸草形成的共生關系會促進白車軸草的生長發育［44-45］。

細胞膜是細胞最重要的防護系統，丙二醛和相對電導率是衡量細胞膜受傷程度的重要指標，鹽脅迫會影響植物活性氧的自由基平衡，過量的自由基導致膜脂過氧化，生成丙二醛等，損害生物膜［46］。相對電導率越大說明細胞受到傷害越大。本試驗中，接種AMF 后，丙二醛含量和相對電導率均顯著降低，AMF 對于白車軸草的生長產生了正向效應。這表明AMF 與白三葉形成共生體系后，細胞膜破壞程度減輕，膜透性降低，緩解了鹽脅迫對白三葉的負效應［47］。

植物相對含水量是表征植物生長狀況的重要指標，本研究中，接種AMF 后，相對含水量顯著增加。這可能是因為AMF 通過菌絲來增加根系的吸收范圍，增加宿主植物的含水量［12］，緩解鹽脅迫的損傷［19，48］。植物葉綠素熒光參數的變化在一定程度上反映了環境因子的變化及其對植物光合生理產生的影響。通過測定植物的PSⅡ最大光能轉換效率，推測植物對特定環境的適應性和抗逆性是一條較為有效和便捷的途徑［49］。本研究中，接種AMF 后，植物的PSⅡ最大光能轉換效率增加，說明AMF 可以緩解鹽脅迫對植物的負面影響，對植物的生長具有促進作用。

在鹽脅迫條件下接種AMF 真菌，促進了白車軸草對水分，無機物和有機物、可溶性蛋白、可溶性糖和游離脯氨酸等的吸收［1］，平衡滲透壓，保證細胞的正常代謝［33］。本試驗中，接種AMF 后白車軸草植株脯氨酸含量顯著增加。目前，在鹽漬環境中接種AMF 時，脯氨酸的含量變化原因仍有爭議，主要存在3 種觀點：一些學者認為，在鹽脅迫下，植物通過提高體內脯氨酸含量，減少鹽害對植物的損傷［39］，脯氨酸積累越多，植物耐鹽能力越強。例如紫花苜蓿（Medicago sativa）［29］、芹菜（Apium graveolens）［50］、西瓜（Citrullus lanatus）［51］等植物在鹽脅迫與接菌的雙重作用下，脯氨酸含量普遍顯著提高，因此認為AMF 能通過積累脯氨酸來提高植物耐鹽性。另一些試驗證明，在高鹽脅迫下，植物體受鹽害影響，會出現脯氨酸含量積累的現象，脯氨酸積累越多，植物遭受鹽害越嚴重，植株在鹽脅迫下接種AMF 后，脯氨酸含量降低，植株受鹽脅迫傷害程度減輕［52］。還有研究指出，脯氨酸在總有機溶質中的相對豐度較低，在逆境中對抗性的表現并不明顯［53］。本試驗中，驗證了在鹽害逆境中，植物通過提高體內脯氨酸含量，減少鹽脅迫對植物的損傷這一結論。

4 結論

本研究表明鹽脅迫處理導致白車軸草丙二醛含量和相對電導率上升，相對含水量降低，可溶性糖和游離脯氨酸的含量提高，不利于白車軸草的生長發育。在鹽脅迫下接種AMF，丙二醛含量和相對電導率下降，PSⅡ最大光能轉換效率，相對含水量，可溶性糖和游離脯氨酸含量上升，說明接種AMF 可以減輕鹽脅迫對其帶來的負面影響，有利于白車軸草的栽種及其在鹽漬土地上的綠化推廣。本研究結果對今后在鹽漬土地種植白車軸草，擴大綠化面積提供了理論依據，同時在微生物菌肥研發和推廣中具有重要參考價值。