結(jié)直腸癌組織中Lgr5、GATA6表達(dá)變化及臨床意義

于思雨，榮光宏

1 青海大學(xué)研究生院，西寧 810000；2 廣東醫(yī)科大學(xué)附屬東莞第一醫(yī)院消化內(nèi)科

據(jù)2020年世界癌癥統(tǒng)計(jì)指出，在36種常見癌癥中，結(jié)直腸癌（CRC）新發(fā)病例超過190 萬，死亡人數(shù)93.5 萬，約占癌癥病例和死亡人數(shù)的1/10，其發(fā)病率和死亡率排名分別為第3、4 位［1］。CRC 早期臨床癥狀隱匿，很多患者在首次接診時已進(jìn)展為中晚期，早期診斷率極低。此外，CRC 預(yù)后較差，大大降低了患者的5 年生存率。CRC 的患病年齡趨于年輕化，其死亡原因與腫瘤侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系。因此，尋找高特異性和高敏感性的腫瘤標(biāo)志物，可以為CRC 的早期診斷和治療提供新的思路。有研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤干細(xì)胞（CSC）是惡性腫瘤中具有自我更新和多向分化潛能的細(xì)胞群，與腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥等密切相關(guān)［2］。富含亮氨酸重復(fù)單位的G 蛋白耦聯(lián)受體5（Lgr5）是腫瘤干細(xì)胞表面標(biāo)志物，其參與腫瘤的形成、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和治療抵抗［3-4］。轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GATA 結(jié)合蛋白6（GATA6）能增強(qiáng)尿激酶型纖溶酶原激活物的活化性，提高癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移能力，也可以通過抑制15-脂氧合酶-1 的表達(dá)調(diào)節(jié)CRC 細(xì)胞增殖［5-6］。本研究探討Lgr5 和GATA6 在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)變化及臨床意義，為CRC 的早診斷、早治療提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2020年1月—2021年12月就診于青海省人民醫(yī)院的CRC患者41例，均行手術(shù)切除 治療，男24 例、女17 例，年 齡30～89（60.61 ± 13.23）歲；分化程度為低分化8 例、中高分化33 例；TNM 分期Ⅰ、Ⅱ期22 例，Ⅲ、Ⅳ期19 例；浸潤深度未及漿膜10 例，侵及漿膜及漿膜外31 例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17 例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移24 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)后病理檢查確診為CRC；術(shù)前未行放化療；未合并其他惡性腫瘤及重大基礎(chǔ)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他良性或惡性腫瘤；合并心、腦、肝、肺、腎等臟器功能衰竭；合并癌癥相關(guān)炎癥性腸病和家族性腺瘤性息肉病；妊娠期、哺乳期；正在參與其他醫(yī)學(xué)研究；臨床病理資料不完整。本研究經(jīng)青海省人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬簽署知情同意書。

1.2 標(biāo)本采集 術(shù)中取41例CRC患者的癌組織及配對的癌旁正常組織（距離癌組織邊緣＞5 cm），用4%甲醛溶液固定，石蠟包埋，使用石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為4 μm。

1.3 Lgr5、GATA6 蛋白表達(dá)檢測 采用免疫組化法。取上述兩種組織切片，依次置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ溶液中各浸泡10 min，隨后依次放入100%、100%、95%、70%、50%、30%乙醇及蒸餾水中各浸泡5 min。取出置于PBS 液中，于搖床上洗滌3 次，每次3 min。每張切片滴加3%過氧化氫去離子水阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性，室溫下避光孵育10 min。取出后置于PBS 液中，于搖床上洗滌3 次，每次3 min。將檸檬酸鹽抗原修復(fù)液于微波爐高火加熱5 min，沸騰后放入組織切片，加蓋，然后低火加熱20 min。取出后置于PBS 液中，于搖床上洗滌3 次，每次3 min。用10%正常山羊血清封閉非特異性抗原，室溫下封閉40 min。甩去多余液體，根據(jù)組織大小，滴加稀釋的一抗兔抗人Lgr5多克隆抗體、兔抗人GATA6多克隆抗體（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）稀釋比例分別為1∶300、1∶100），置于濕盒中4 ℃冰箱孵育過夜。次日取出濕盒，將組織切片置于PBS液中，于搖床上搖動洗滌3 次，每次5 min。吸水紙擦干切片，滴加適量二抗（Polyperoxidase-anti-Rabbit-IgG 即用型），需完全覆蓋組織，室溫下孵育2 h。然后置于PBS 液中，于搖床上搖動洗滌3 次，每次5 min。擦干組織周圍液體，每張切片滴加50 μL現(xiàn)配的DAB工作液，顯微鏡（×400）下觀察顯色情況，然后自來水洗滌終止顯色。蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，用自來水清洗，返藍(lán)。將切片置于無水乙醇3 min、二甲苯3 min 脫水透明。晾干后用中性樹膠封片，顯微鏡（×400）下拍照。結(jié)果判定：Lgr5陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，GATA6 陽性染色主要定位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，均呈棕黃色顆粒。顯微鏡下每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)10 個高倍視野（×400），觀察細(xì)胞染色情況，對染色強(qiáng)度、陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評分。染色強(qiáng)度評分：無色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性細(xì)胞百分比評分：陽性細(xì)胞百分比≤5%計(jì)0 分；5%＜陽性細(xì)胞百分比≤25%計(jì)1 分；25%＜陽性細(xì)胞百分比≤50%計(jì)2 分；50%＜陽性細(xì)胞百分比≤75%計(jì)3分；陽性細(xì)胞數(shù)＞75%計(jì)4分。以上兩項(xiàng)評分相乘≥3為高表達(dá)，＜3為低表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman 秩相關(guān)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CRC 組織及癌旁正常組織中Lgr5、GATA6 蛋白表達(dá)比較 CRC 組織及癌旁正常組織中Lgr5 蛋白高表達(dá)率分別為60.98%（25/41）、12.20%（5/41），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；CRC 組織及癌旁正常組織中GATA6 蛋白高表達(dá)率分別為63.41%（26/41）、21.95%（9/41），比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 Lgr5、GATA6 蛋白高表達(dá)與CRC 患者臨床病理特征的關(guān)系 Lgr5 蛋白高表達(dá)率與CRC 的TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度和浸潤深度無關(guān)（P均＞0.05）。GATA6 蛋白高表達(dá)率與CRC 的浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)（P均＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、分化程度和腫瘤分期無關(guān)（P均＞0.05）。見表1。

2.3 CRC 組織中Lgr5、GATA6 蛋白表達(dá)的相關(guān)性 Spernman 秩相關(guān)分析結(jié)果顯示，CRC 組織中Lgr5、GATA6蛋白表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.327，P＜0.05）。

3 討論

臨床上大多數(shù)CRC 患者在確診時已是中晚期，錯過最佳手術(shù)時機(jī)，大大降低了CRC 患者的生存率。目前，腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測已廣泛應(yīng)用于臨床，作為一種常規(guī)的腫瘤篩查方法以輔助腫瘤的診斷和評估預(yù)后。了解CRC 的發(fā)生機(jī)制并進(jìn)行早期干預(yù)，對提高CRC的療效和延長患者生存期有重要意義。

研究表明，腫瘤干細(xì)胞雖然數(shù)目極少，但在腫瘤干細(xì)胞內(nèi)與早期胚胎發(fā)育相關(guān)的多種信號通路被異常激活，從而呈現(xiàn)出強(qiáng)致瘤能力及細(xì)胞分化能力，信號通路的激活可通過相關(guān)生物標(biāo)志物進(jìn)行監(jiān)測［7-8］。因此，通過檢測腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物在腫瘤組織中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系，可以為腫瘤的早期診斷及治療提供重要依據(jù)。Lgr5 是一種7 次跨膜的G 蛋白，具有17 個富含亮氨酸重復(fù)序列，在食管腺癌、肝細(xì)胞癌、卵巢癌、基底細(xì)胞癌及CRC 中呈現(xiàn)高表達(dá)，并且在這些惡性腫瘤的病情進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。研究表明，Lgr5是Wnt信號傳導(dǎo)的靶基因，可參與細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、膠原蛋白及纖黏蛋白的表達(dá)，也可參與調(diào)控CRC 細(xì)胞中Wnt/β-catenin 信號通路的激活，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖及侵襲等生物學(xué)行為［9］。GATA6 屬于轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子GATA 家族，具有高度保守的鋅指結(jié)構(gòu)，參與細(xì)胞的多種生物學(xué)行為，其異常表達(dá)與肺癌、卵巢癌、口腔癌、消化道腫瘤等的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［10］。研究發(fā)現(xiàn)，GATA6 在CRC 患者中表達(dá)增加，參與腸上皮細(xì)胞分化，通過激活Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮促癌作用［11-12］。此外，Lgr5、GATA6 與腫瘤的直徑、浸潤深度、分化程度、TNM 分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理學(xué)特征有關(guān)［13-16］。腫瘤TNM 分期是由腫瘤原發(fā)灶情況、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移共同決定。TNM 分期越高，腫瘤惡性程度就越高。研究發(fā)現(xiàn)，在CRC 組織中GATA6表達(dá)陽性率高于癌旁組織，且TNM 分期Ⅲ、Ⅳ期及低分化、浸潤深度深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，GATA6陽性率高，提示GATA6表達(dá)與CRC發(fā)生和進(jìn)展密切相關(guān)［15-16］。本研究結(jié)果顯示，Lgr5、GATA6 在CRC 組織、癌旁正常組織中均有表達(dá)，但CRC 組織中Lgr5、GATA6 的高表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織，提示兩者與CRC 的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。同時，在TNM 分期為Ⅲ、Ⅳ期和有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC 患者中，Lgr5 的高表達(dá)率高；在腫瘤的浸潤深度達(dá)漿膜及漿膜外、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的CRC 患者中，GATA6的高表達(dá)率高。提示Lgr5、GATA6 的表達(dá)與CRC 的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，可作為評價腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移傾向的指標(biāo)之一。

此外，有研究指出GATA6 可以通過結(jié)合至Lgr5的啟動子區(qū)調(diào)控Lgr5 的表達(dá)，進(jìn)而影響結(jié)直腸腫瘤細(xì)胞系的成瘤能力，抑制CRC 細(xì)胞系GATA6 的表達(dá)，可下調(diào)Lgr5 的表達(dá)并進(jìn)而降低其致瘤能力［17-19］。GATA6 長非編碼RNA（lncGATA6）在Lgr5 陽性表達(dá)的人腸干細(xì)胞（ISC）中高表達(dá)，如果敲除或條件性敲除ISC 中的lncGATA6，則會損害ISC 的干性和上皮再生，從而說明lncGATA6 維持腸道干細(xì)胞的干性并促進(jìn)腫瘤的發(fā)生；其發(fā)生機(jī)制可能為lncGATA6將NURF 復(fù)合物募集到Ehf 啟動子上，以誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)LGR4/5 的表達(dá)，以促進(jìn)Wnt 信號通路的激活，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展，這表明長非編碼RNA可通過調(diào)控Lgr5 或影響Lgr5 陽性CRC 干細(xì)胞的生物學(xué)特性，從而促進(jìn)CRC 的發(fā)展［20-21］。本研究結(jié)果顯示，Lgr5和GATA6在CRC組織中的表達(dá)表現(xiàn)為正相關(guān)，兩者共同促進(jìn)CRC 的發(fā)展。這提示Lgr5 和GATA6都可作為CRC 治療的靶點(diǎn)，聯(lián)合靶向治療可能會提高CRC的療效。

綜上所述，Lgr5 和GATA6 在CRC 組 織中高表達(dá)，與CRC 的惡性生物學(xué)行為有關(guān)，且二者共同參與CRC 的發(fā)生發(fā)展，因此檢測Lgr5 和GATA6 有助于CRC 患者的診斷及預(yù)后評估。但本研究樣本量相對較少，且未對Lgr5、GATA6 的作用機(jī)制進(jìn)行研究。因此，未來仍需開展大樣本、多中心的臨床研究進(jìn)一步論證本研究結(jié)果，尋找診斷效能更高的標(biāo)志物或聯(lián)合診斷標(biāo)志物。