BRCA基因檢測進展

林司杭 周文斌

暨南大學第二臨床醫學院 深圳市人民醫院甲乳外科，廣東深圳 518020

BRCA1/2基因突變可以導致乳腺癌、卵巢癌等風險增加。BRCA1和BRCA2突變攜帶者患乳腺癌累積風險分別為72%和69%，對側乳腺癌累積發病率分別高達83%和62%；15%～22%的卵巢癌由BRCA1/2基因突變導致，且終身危險度由1%～2%升至60%～70%；BRCA1/2突變攜帶者的一級親屬患前列腺癌風險是正常人群1.7倍；故BRCA1/2基因檢測對癌癥的早期發現、預后等有重要意義[1]。

目前攜有BRCA突變癌癥患者可從鉑類藥物及腺苷二磷酸核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）抑制劑等獲益。研究表明鉑類藥物可延長BRCA突變攜帶者的無進展生存期。攜帶BRCA1/2胚系突變的三陰性乳腺癌患者對鉑類藥物較敏感，而對紫杉醇類藥物有抗性。在Ⅲ期試驗中，發現BRCA1/2胚系突變的三陰性乳腺癌患者對鉑類藥物客觀反應率及無進展生存期均高于紫杉醇。2018年1月美國批準奧拉帕尼（Olaparib）治療攜帶BRCA突變的人表皮生長因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，HER-2）陰性的轉移性乳腺癌。Ⅲ期臨床試驗發現奧拉帕尼組可降低攜有BRCA1/2突變的轉移性激素受體陽性或三陰性乳腺癌患者42%的疾病進展風險、延長無進展生存期約2.8個月[2-3]。

BRCA1/2基因檢測技術歷經了低通量的第一代測序、高通量二代測序，再到如今單分子第三代測序。三代測序在不同時代背景下開發出來，有各自優缺點。第一代測序盡管有成本高、低通量、應用局限等缺點，但目前仍為基因檢測金標準。二代測序則彌補一代測序的不足，具備測序速度快、通量高等優勢。但也存在短讀長的技術短板。三代測序最大特點是能單分子測序，具有讀長變長、測序時間減少等優勢。且不需進行PCR擴增，這能有效避免PCR偏好性導致的錯誤測序[4-5]。

對于BRCA突變陽性患者，由于國內外人群特征、醫療水平、臨床指南不同等原因，導致BRCA1/2基因檢測應用有所差異。筆者將綜合闡述當前BRCA基因應用的最新進展，從而可以更好地為精準醫療服務。

1 BRCA1/2變異測序技術的發展歷程

在過去的20年內，每一代基因測序在規模、通量等都有了極大的發展。1975年Frederick Sanger發明的“雙脫氧鏈終止法”及Walter Gilbert在1977年提出的“化學測序法”，意味著第一代測序出現。

一代測序存在通量低、成本較高等問題，無法滿足當前分子生物學等對于高通量、高效率、高產出的測序需求，從而衍生出如今的二代測序。2005年Roche公司推出以焦磷酸合成測序法為原理的454平臺，其利用乳膠系統對DNA分子進行擴增，避免了傳統方法的煩瑣步驟，實現了大規模并行測序。Life Technologies公司在2008年推出的半導體測序很快在外國測序市場響應，ABI公司SOLiD測序受其影響逐漸沒落。華大基因作為中國本地測序公司，在2014年發明了二代測序儀器—BGISEQ-1000型號，其優勢體現在大規模DNA測序和小RNA分析，但轉錄組分析的性能仍需進一步完善[6-8]。

2010年前后，可滿足長讀長和快速測序的三代測序平臺開始興起。2008年Helicos Bioscience公司發明的Heliscope測序平臺以單分子測序技術為基礎；同年，ONT公司推出新型納米孔單分子測序儀器，因為機器還不穩定，還需反復檢測，故還不能投入市場；Pacific Bioscience測序平臺2009年發明的單分子實時測序技術可以對特定的模板進行檢測，滿足實時測序的需求[9]。

2 BRCA1/2一代基因測序平臺原理和優缺點

Sanger測序法，又稱第一代測序技術，釆用直接測序的方法對各堿基熒光標記進行DNA序列分析，方法簡便易行，結果直觀。至今仍作為各基因突變檢測方法的金標準。一代測序檢測片段最長可達800～1000 bp，且有很高精確度，可達99.999%。一代測序由于對于長片段基因操作上較難實現、費時費力、消耗大量成本等問題，限制了其廣泛應用。

3 BRCA1/2二代基因測序平臺原理和優缺點

下一代測序技術即二代測序，是當前適合BRCA基因變異的檢測技術。二代測序可未知序列時，對DNA片段進行測序；可同時檢測多基因來指導腫瘤的早期預防及給予患者更加精準的個體化治療。

當前國內外二代測序平臺參差不齊，有各自優劣勢，在臨床及基礎醫學有不可替代的地位[10-11]。

3.1 Roche/454測序平臺

Roche公司推出以邊合成邊測序技術為原理的454焦磷酸測序，是當前第一臺較為穩定的測序平臺，其主要采用焦磷酸測序法。該項測序技術的測序原理大致為將模板進行PCR擴增后，與相應的引物、DNA聚合酶等共同孵育進行酶促反應。在酶促反應中，會釋放出焦磷酸基團和產生光信號，然后被電荷耦合元件光學系統捕捉并讀取DNA序列信息。該平臺精確度較高、耗時間較短和效率高。由于測序成本較高，限制了其在市場的普及。

3.2 Life/SOLiD測序平臺

SOLiD平臺原理為連接法和雙堿基編碼。在測序過程更換引物及替代了之前的聚合酶連接反應，雙堿基編碼對測序錯誤進行校正，來提高測序的精準度。與GS FLX測序相像，在PCR擴增和構建文庫上，都用磁珠接頭來檢測DNA序列。不一樣的方面是SOLiD平臺的磁珠比GS FLX小得多。當前SOLiD系統稱其測序準確度大于99.94%[12]。

3.3 Ion Torrent測序平臺

Ion Torrent的核心技術為半導體技術。測序大致是將DNA鏈錨定在半導體芯片的微孔上，然后加入堿基，過程會釋放出氫離子。通過對H+的檢測，實時判讀堿基。Ion Torrent平臺可測定DNA片段的合成，減少了CCD掃描等操作，從而耗時短。檢測H+可以大大提高堿基判讀精準性，同時測序成本較低；其劣勢為讀長較短及測序準確率不高[13]。

3.4 華大基因CG平臺

CG平臺測序原理為DNA納米芯片技術，測序大致為將DNA納米球錨定在芯片上，然后通過探針錨定分子連接技術來檢測DNA序列。CG平臺推出的從頭拼接技術，能夠檢測等位基因雜合子突變，其靈敏性高；為降低探針和酶的濃度，平臺利用的是組合探針錨定連接法技術。其優勢為可一次性讀取數個堿基，減少耗時。每次檢測都不因前一次測序結果影響，所以不會出現錯誤累積。但讀長較短是其不可避免的短板。

3.5 不同二代測序平臺的比較分析

不同二代測序平臺各有特點，在通量、讀長、準確率及成本等各有表現。羅氏454作為最早測序儀，讀長較長，運行較快。但成本較高、錯誤率也較高；SOLiD測序儀用于外顯子和基因突變測序，測序準確率較高，然而讀長較短，運行較慢，目前已淡出市場；Ion Torrent測序平臺準確率較高，測序成本低，但讀長較短。若單個堿基出現得多則產生許多的H+，使pH值降低，導致測序不精確；華大基因CG平臺堿基讀取完全獨立，可降低錯誤率，且價格低，不足之處為讀長較短。

4 BRCA1/2三代基因測序平臺原理和優缺點

2008年，三代測序技術誕生。彌補了第二代短讀長，無法完整解析復雜重復序列的短板。三代測序不需要依賴PCR技術，測序壓縮至數小時內。其最大特點為單分子測序技術。但目前仍處于技術發展期，其堿基識別準確度仍有較高錯誤率且成本較高，限制其大規模應用。目前國內外占主流的三代測序平臺有SMRT測序、納米孔SMS測序平臺、SMS測序平臺及SFRET測序平臺[14-15]。

4.1 Heliscope測序平臺

Helicos Bioscience公司的單分子測序平臺，其推出市場上第一個三代測序儀，主要原理為邊合成邊測序（sequencing by synthesis，SBS）技術，測序步驟大致為：①將DNA大片段剪成小片段后加尾；②含接頭的文庫通過末端尾巴固定在探針完成裝載；③延伸DNA模板鏈，并釋放熒光信號；④電荷耦合元件收集光學信號。其避免了擴增時引入錯配堿基以及擴增偏好性[16]。但存在短讀長的技術短板，且設備要求較高。目前尚未得到廣泛的應用。

4.2 SMRT測序平臺

SMRT測序是目前使用率較高的技術。零級波導的納米結構和dNTP熒光標記為其檢測基礎。在構建文庫時，模板與引物結合，將熒光標記的dNTP加入微反應器延伸DNA模板鏈，設備收集熒光信號和測序。該平臺在讀長上實現了較大的突破，讀長能達到30 kb。且對GC重復區、堿基修飾區保持高識別精確率。其短板為過分依賴單分子釋放的熒光信號，從而檢測精確率較低，僅為87.5%。

4.3 納米孔SMS平臺

2014年，英國ONT公司推出MinION測序平臺，測序大致步驟：①馬達蛋白與接頭連接在待測模板一端；②帶有接頭的DNA及混合物加載至流動池；③馬達蛋白將雙鏈DNA解旋為單鏈通過納米孔；④不同堿基產生不同電信號，由傳導電子元件等處理和確定堿基信息。

4.4 FRET測序平臺

FRET平臺測序大致過程為標記的脫氧核苷酸分子隨著測序引物延長會釋放熒光信號，由熒光收集設備收集和測序。該平臺測序時長較短，且讀長較長。測序準確率相對于其他三代測序平臺較高。由于該儀器缺乏具體的應用參數，目前尚未得到廣泛應用[17]。

4.5 不同三代測序平臺的比較分析

由于各三代測序平臺建數據庫和儀器原理等存在差異，導致通量、讀長、測序準確率以及成本等有差異。當前三代測序共存特點為不依賴PCR構建文庫、成本低、讀長長及耗時短；Heliscope測序為第一個商品化的平臺，其技術短板為短讀長，且測序過程中信號較弱容易產生測序誤差，導致準確率降低，從而限制其應用；MinION測序平臺讀長長、檢測周期較短為其優勢，但該測序儀器錯誤率較高，準確率僅65%～88%，目前該測序平臺尚未得到廣泛的應用。納米孔SMS平臺由傳導電子元件等處理和確定堿基信息，讀長可達10 kb。由于堿基前進速度具有隨機性，間隔太短時堿基識別易錯失，導致較高錯誤率，準確率僅為65%～88%，限制了其應用。FRET測序平臺耗時短，且檢測精確率較其他平臺較高，缺乏具體應用參數，故應用范圍極少[18]。

5 各代測序平臺比較

三代測序技術在不同時代開發出來，有各自優缺點。相比二、三代測序，一代測序釆用直接測序，操作簡易，且有極高的精確度，可達99.999%。目前仍作為各基因突變檢測的金標準，可驗證其他檢測篩查出來的變異。然而，對于長片段基因，操作上較難實現，消耗大量時間和成本。

相比一代測序，NGS方法測序通量更高、應用領域更廣，能檢測BRCA基因的全部外顯子，能完成各種突變類型的分析。但有不少問題，譬如，PCR一定程度提高假陽性率，且具有測序偏好性。其次，目前很多機構開展NGS檢測，但檢測服務良莠不齊，質量難以保證。

三代測序最大特點是單分子測序，相比前兩代測序，改善有：①讀長變長；②測序流程簡化，測序時間短；③避免PCR造成的擴增偏好；④可測定堿基修飾情況。其短板為檢測錯誤率較高、技術不成熟，且分析數據過分依賴軟件處理[19]。

6 國內外BRCA1/2基因檢測比較

①相比于美國、日本等發達國家，目前國內BRCA1/2基因檢測比例非常低，就乳腺癌患者來說，檢測比例不超過10%，大部分集中于大醫院，而中小醫院基本沒有做，部分中小醫院醫生甚至不知道其意義，以及不知如何提供遺傳咨詢和預防措施；②目前國內尚無中國人群的突變數據庫，國內醫院或者外部檢測機構評估BRCA1/2基因是否突變，主要參考國外的大樣本數據數據庫，而非國內人群的突變數據庫。由于國內外人群的差異，檢測結果準確性尚待商榷；③國內醫院很少BRCA1/2基因檢測。大部分為外部檢測公司承包，檢測水平參差不齊，尚無質控部門對結果進行把關，故結果穩定性不足；④國內不管醫院還是外部檢測公司，測序平臺、變體解釋等方面存在巨大差異，差異可以歸因于國內檢測實驗室缺乏標準統一的檢測指南[20]。

7 目前BRCA1/2基因檢測的現狀及存在的問題

目前基因檢測存有不少的局限與弊端。①對BRCA1/2的認識不夠透徹，如5%的BRCA突變基因類型為未知變異，與疾病的關系也未知，導致檢測結論不確定；②國內外指南對BRCA突變的解讀不一致，導致部分結論存在爭議；③國內BRCA1/2基因檢測采用不同方法，可能導致結果不一致；④由于腫瘤具有異質性，譬如不同腫瘤細胞之間的基因突變譜不同等，故每一次結論可能存在差異[21]。

8 BRCA1/2基因突變攜帶者預防性措施

癌癥患者通過BRCA1/2基因檢測確定攜有BRCA基因突變。目前這些患者可以通過保乳治療、預防性乳房切除手術及預防性雙側輸卵管卵巢切除術等來改善預后。國內專家認為保乳術后同側殘余乳腺組織和對側乳腺組織仍有較高的乳腺癌發病風險，在術后給予充分輔助治療及隨訪的前提下可進行保乳手術[22]。

BRCA1、BRCA2和非BRCA1/2致病變異攜帶者患對側乳腺癌的年平均風險分別為4.0%、2.9%和1.9%。國內專家認為如果組織學分級、細胞增殖指數較高，且激素受體表達陰性，可以考慮對側乳房預防性切除手術來提高患者預后[23]。

國內外專家一致認為預防性雙側乳腺切除術可以有效降低BRCA突變基因攜帶者乳腺癌復發的風險。由于我國患者群體BRCA基因突變數據不夠完善、接受程度有限以及存在手術相關并發癥的原因，在進行全面多學科評估，包括乳房檢查、雙側鉬靶和MRI檢查等前提下，可以考慮此術式[24]。

攜有BRCA1/2致病基因的乳腺癌患者行預防性雙側輸卵管卵巢切除術可將健康突變攜帶者患卵巢癌的風險降低到1%～2%，總病死率降低到25%，提高總體存活率。絕經前婦女行預防性雙側輸卵管卵巢切除術可以降低50%的乳腺癌風險，同時患對側乳腺癌的風險可以降低30%～50%[25]。

9 總結

隨著當前技術的進展，BRCA1/2檢測越來越多在臨床應用，在指導臨床實踐、進行遺傳風險評估、抉擇治療方案和判斷預后中起決策性作用。相信未來隨著對BRCA1/2基因突變的認知加深及檢測技術的進一步完善，BRCA基因檢測結果的判定會越來越準確，可以更好地為精準醫療服務。