大孔樹脂吸附銀杏葉萜類內酯的使用壽命及強化再生的研究

陶娟娟，胡佑彪，王 玉，鄭元濤，石炳光，陳志元

（勁牌持正堂藥業有限公司，湖北 黃石 435000）

0 引言

銀杏葉又稱公孫樹，是銀杏科植物銀杏（Ginkgo biloba L.） 的干燥葉，采收季節為秋季葉片呈葉綠時，并及時干燥[1-2]。藥理研究表明，銀杏葉中的有效成分具有活血化瘀、通絡止痛、斂肺平喘、化濁降脂等功效[3-5]。銀杏內酯中的A，B，C 等均是二萜類內酯，白果內酯屬于半萜類內酯，為銀杏中特有成分，是一種良好的血小板活化因子（Platelet activating factor，PAF） 拮抗劑[6]。

大孔樹脂大多是一種以芳香基化合物為原料，通過工業方法合成的多孔骨架結構，其具有穩定性強、吸附效率高、純化效果好等優點[7-8]。目前，大孔樹脂普遍應用于天然產物的分離、純化生產上。大孔樹脂在工業應用過程中會遇到諸多問題，如樹脂老化、樹脂再生困難、樹脂單體殘留對終產物二次污染等[7]。近年來，國內對樹脂性能的研究較多，主要集中于樹脂種類選擇、吸附效率對比、分離純化參數優化、終產物中樹脂殘留物檢測分析等方面[6，9-10]。然而，在實際生產過程中樹脂使用壽命及再生方式對于生產成本和資源利用影響較大。課題組未見大孔樹脂吸附銀杏葉萜類內酯的使用壽命及強化再生的研究。因此，課題組以D101 型大孔樹脂吸附銀杏葉萜類內酯的工藝優化為前提，進一步對D101 型大孔吸附樹脂吸附銀杏葉萜類內酯的使用壽命及強化再生工藝進行深層次研究，從而為D101 型大孔吸附樹脂純化銀杏葉萜類內酯的工業化生產提供數據支持。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀，配有蒸發光散射檢測器；電子天平（萬分之一電子天平、十萬分之一電子天平）；純水/超純水一體系統，默克密理博公司產品；5 cm×50 cm 的玻璃柱（用于裝填大孔樹脂）。

銀杏葉，購自湖北省藥材公司，在湖北省中藥配方顆粒工程中心技術研究中心鑒定，為銀杏科植物銀杏的干燥葉；大孔吸附樹脂（D101 型食品級），天津市海光化工有限公司提供；銀杏葉總內酯對照提取物（供含量測定用，批號為610017-201501，中國食品藥品檢定研究院提供；甲醇、鹽酸、乙酸乙酯、醋酸鈉，均為分析純；正丙醇、四氫呋喃，均為色譜純。

2 方法與結果

2.1 銀杏葉提取液制備

稱取切碎后的銀杏葉藥材1.0 kg，使用8 倍（M/V） 60%（V/V） 乙醇回流提取3 次，每次提取1 h，合并3 次提取液，200 目濾袋濾過后濃縮至膏狀，加入純水溶散后過D101 型大孔樹脂柱，純水洗柱后，分別用體積分數為30%和60%乙醇溶液進行梯度洗脫，回收60%乙醇洗脫液，采用減壓濃縮至膏狀，真空干燥，最后用3 倍體積乙酸乙酯、4 倍體積丙酮分別洗脫樹脂，回收乙酸乙酯洗脫液，加一定量的水溶液溶散，用等比例的環己烷提取3 次，水液減壓濃縮得溶液A。回收丙酮洗脫液，加一定量的水溶液溶散，靜置過濾，上聚酰胺（200 目） 柱，用等比例水洗脫3 次，4 倍（M/V） 70%乙醇洗脫4 次，收集洗脫液后，與A 兼并，真空干燥，即得銀杏總內酯[11]。

2.2 溶液配置

2.2.1 銀杏葉提取液制備

稱取銀杏葉提取物150 mg（精密稱定），加10 mL水溫熱溶散，用20 mL 乙酸乙酯旋轉提取2 次，回收乙酸乙酯提取液，用甲醇轉移至10 mL 容量瓶中并定容。充分搖勻后過濾，取續濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液制備方法

精密稱取銀杏葉總內酯對照提取物，加甲醇定容，充分搖勻后過濾，取續濾液，即得。

2.2.3 色譜條件填充劑：十八烷基硅烷鍵合硅膠（如Waters T3色譜柱4.6×250 mm，5 μm）；流動相：正丙醇∶四氫呋喃∶水（1∶15∶84） 等度洗脫；流速1.0 mL/min；檢測儀器：蒸發光散射檢測器檢測[9]，漂移管溫度100 ℃，氣流量2.5 L/min，柱溫30 ℃。

2.2.4 含量測定

精密稱取銀杏葉總內酯對照提取物適量，加甲醇定容，充分搖勻后過濾，取續濾液。

2.2.5 結果計算

分別以萜類內酯4 種對照品出峰時間定性，以各對照品濃度的對數為橫坐標，各色譜峰面積的對數為縱坐標建立4 種成分標準曲線，將樣品中相應色譜峰面積帶入標準曲線中即可得出供試品中各成分的濃度，并計算4 種內酯成分的總量。產品按干燥品計算，含萜類內酯以銀杏內酯A（C20H24O9），銀杏內酯B（C20H24O10），銀杏內酯C（C20H24O11） 和白果內酯（C75H18O8） 的總量計，不低于0.25%。

試樣中4 種萜類內酯的含量分別按下列公式計算，再將4 種萜類內酯含量相加即得到樣品中萜類內酯總含量。

式中：X——試樣中各萜類內酯的含量，%；

C——供試品中各萜類內酯的質量濃度，mg/L；M——供試品取樣量，g。

2.3 大孔樹脂吸附銀杏葉萜類內酯使用壽命考查

D101 型大孔樹脂再生工藝：第1 步，用95%乙醇浸泡4～6 h；第2 步，用1 倍樹脂量的95%乙醇沖洗樹脂；第3 步，用5 倍樹脂量的純化水洗至無醇味；第4 步，等量稱取3 份處理好的樹脂，使用真空機抽濾樹脂內多余的水分，使樹脂干質量約600 g；第5 步，分別裝入3 根同體積樹脂柱中；第6 步，采取最佳生產工藝取4 800 mL 銀杏葉提取液，離心澄清后上樹脂柱，上樣吸附11.5 h，然后以滴速為500 mL/min 進行洗脫；第7 步，用4～5 倍柱體積的純水沖洗樹脂內的料液澄清透明、無醇味，完成以上洗脫步驟。累計生產54 次吸附，合并洗脫液進行定容，測萜類內脂的含量，統計比吸附量，計算公式如下。

以吸附次數為橫坐標，比吸附量為縱坐標，做出吸附能力變化趨勢圖。

吸附能力變化趨勢見圖1。

從圖1 可知，第1 次生產的樹脂比吸附量約98%，隨著樹脂吸附量的累計增加，樹脂吸附能力出現衰退現象，在生產35 次后，吸附能力較穩定，生產到54 次比吸附量為70.23%，說明樹脂生產54 次后出現性能下降。

圖1 吸附能力變化趨勢

2.4 大孔樹脂強化再生方法考查

取“2.2”項下生產54 次的樹脂驗證，分別均分裝柱，按照下列3 種工藝進行再生優化，再生后加入銀杏葉提取液吸附，計算比吸附量。

3 種再生處理方法的比較見表1。

從表1 可知，隨著生產批次的累加樹脂經強化再生優化后，樹脂吸附性能可恢復至樹脂初期狀態，結合樹脂實際生產用量、操作便捷性等因素考慮，故最優的再生工藝為：第1 步，使用4% NaOH 浸泡4 h，純水清洗至中性；第2 步，配置4% HCl 溶液浸泡樹脂4 h，純水洗至pH 值中性；第3 步，用2 倍柱體積95%乙醇頂淋沖柱；第4 步，使用蒸餾水洗至pH 值7，再投入使用。

表1 3 種再生處理方法的比較

3 結論

大孔樹脂壽命和再生工藝作為天然藥物中有效分離工藝的一種處理方式。按照國家食品藥品監督管理局發布的規定，吸附同一品種產物的樹脂，當樹脂解析率下降至30%以上時，不適宜再生產使用。當樹脂吸附量逐漸增大后洗脫能力出現衰退，或樹脂再生方式不佳時，均采用強化再生工藝優化，常規生產按樹脂再生方法進行優化，定期可進行酸堿酸工藝優化。受樹脂性能衰退影響產品質量，故建立完善的樹脂再生合格指標是樹脂再生效果的關鍵依據，證明樹脂經批量生產吸附后的純化效果與新樹脂吸附效果無較大差異。將產品有效成分、吸附率、比吸附量等指標作為樹脂再生合格的評價指標，并對D101 型大孔樹脂吸附銀杏葉萜類內脂的吸附量進行試驗驗證，認為樹脂采用再生工藝后的吸附能力可恢復至樹脂初期吸附性能。為中試生產驗證提供有利的數據支撐。

在大孔樹脂上樣吸附、乙醇洗脫工藝前，在上柱前用銀杏葉提取液處理后的靜置液、經過濾再處理、除去一定量不溶性雜質，可有效緩解樹脂柱被雜質堵塞情況，從而延長樹脂生產周期，若發生料液上柱堵塞，常用方法是從樹脂柱底部連接壓縮空氣吹散，并使用反沖水反沖洗，洗漂后呈微小顆粒和漂浮的雜質后，可正常生產運行。