miR-146a-5p對HepG2細胞炎癥反應因子IRAK-1表達的影響

孫雅楠　尹明潔　米穎　李斯

【摘要】? 目的? 檢測miR-146a-5p對肝HepG2細胞白介素受體相關激酶-1（IRAK-1）表達的作用，以及在牙齦卟啉單胞菌P.gLPS（P.gLPS）誘導的細胞炎癥反應下，miR-146a-5p對IRAK-1的作用。方法? 通過細胞培養、P.gLPS刺激以及miR-146a-5p-mimics轉染、細胞蛋白提取及蛋白免疫印跡法等方法，檢測HepG2細胞miR-146a-5p轉染組（A組）、P.gLPS刺激組（B組）、miR-146a-5p轉染+P.gLPS刺激組（C組）以及陰性對照組，比較各組IRAK-1 mRNA及蛋白變化。結果? 四組IRAK-1蛋白表達水平結果顯示，A組水平最低，B組水平最高，組間差異存在意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結果顯示，除了陰性對照組與C組之間差異無統計學意義（P>0.05）外，其他各組間差異均有統計學意義（P<0.05）。結論? miR-146a-5p能夠抑制HepG2細胞IRAK-1蛋白表達，在炎癥反應過程中miR-146a-5p通過抑制IRAK-1的表達發揮抑制炎癥反應的作用。

【關鍵詞】? microRNA-146a-5p；HepG2細胞；牙齦卟啉單胞菌；白介素受體相關激酶-1；實時熒光定量PCR；免疫印跡試驗

中圖分類號? R575.5? ? 文獻標識碼? A? ? 文章編號? 1671-0223（2023）07--03

HepG2細胞是人肝癌細胞株，其表型及細胞功能與肝細胞相似，具有肝細胞所特有的生物學特性，如脂質代謝、炎癥反應、糖調節及RNA的合成等，目前在肝細胞相關的脂代謝、炎癥反應及能量代謝等研究中被用來建立肝細胞模型[1-3]。小分子核糖核酸（microRNA，miRNA）是一類存在于人體循環系統中并且能夠調節生理病理反應的重要因子，其中miR-146a-5p在人類免疫調節功能中具有重要的作用。研究顯示，細胞中、組織液中以及血漿中的miR-146a-5p具有抑制炎癥反應，防止炎癥反應放大的作用[4-5]。白介素受體相關激酶-1（interleukin receptor-associated kinase-1，IRAK-1）是一類炎癥反應調節因子，在機體自身免疫過程中通過調整炎癥因子的表達量[6-7]激活氧化應激反應等作用，具有加重炎癥反應，影響人體正常的生理作用。但是miR-146a-5p是否對HepG2細胞中的炎癥調節因子IRAK-1表達水平產生影響，以及在牙齦卟啉單胞菌（porphyromonas gingivalislipopolysaccharide，P.gLPS）刺激細胞炎癥反應中，miR-146a-5p是否仍能發揮一定的抑制炎癥反應的作用未見報道。因此，本研究通過轉染miR-146a-5p HepG2細胞以及P.gLPS刺激后的HepG2細胞，觀察IRAK-1蛋白表達水平，闡明miR-146a-5p對細胞炎癥反應的影響。

1? 資料與方法

1.1? 實驗分組

本實驗的HepG2細胞系由中國協和醫科大學基礎研究所細胞中心所提供，分為4組：①陰性對照組：單純細胞培養，無轉染及炎癥刺激，培養條件與各組相同；②A組：細胞經miR-146a-5p mimics細胞轉染；③B組：細胞經P.gLPS刺激；④C組：細胞經miR-146a-5p-mimics轉染及P.gLPS刺激。

1.2? 細胞培養

將液氮中凍存的細胞在試管中進行復蘇，在復蘇后的細胞試管中沿管壁逐步輕柔加入一定的DMEM培養液，進一步將復蘇后的細胞稀釋，濃度為105/ml。將細胞輕柔轉移至干燥的培養瓶中，并且在CO2培養箱內再次培養，CO2濃度為37%，在細胞培養過程中通過顯微鏡觀察細胞，如觀察到細胞生長活躍，至鋪滿整個瓶壁，可進行細胞的傳代。

1.3? 細胞轉染及炎癥刺激

1.3.1? 細胞轉染? 用吸管輕柔的吸取250μl miR-146a-5pmimics轉染復合物，將其緩慢加入到細胞孔板中，進一步吸取Opti-MEM培養基，按照750μl/孔的量加入，輕柔混合均勻。設定培養箱的培養條件為溫度37℃、CO2濃度5.0﹪、飽和濕度，培養24h。經轉染6h后，吸取1ml普通DMEM培養基緩慢的加入各培養孔。

1.3.2? 炎癥刺激? B組與C組在實驗中分別加入P.gLPS的濃度為1μg/ml，在培養6h后收獲細胞，并用于后續的蛋白檢測實驗。

1.4? Western blot細胞內蛋白的檢測

細胞在經過轉染清洗之后，進一步應用RIPA裂解上述實驗處理過的細胞，并獲得實驗細胞內的總蛋白。應用考馬斯亮藍法進一步測定所提取的蛋白濃度行SDS-PAGE電泳。取目的蛋白條帶，在恒流電為200毫安的電流下進行轉膜1h。轉膜完成后，將膜用TBST水清洗，進一步進行封閉實驗：將膜輕柔放于封閉液中，并在搖床上進行封閉1h。配制一抗體與一抗稀釋液（比例為按1∶100或1∶200），將封閉好的膜首先放入一抗稀釋液，4℃搖床過夜。配制二抗與二抗稀釋液（按1∶1000或1∶2000的比例），之后將膜放入配好的二抗稀釋液，在常溫的條件下，將膜輕柔放在搖床上搖3h。在二抗孵育實驗完成之后，用TBST清洗3次，進一步加入顯色液，并在凝膠成像系統中進行顯色，記錄實驗結果。

1.5? 數據處理方法

采用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析，P<0.05為差異有統計學意義。正態分布的計量資料使用“±s”表示，四組均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD方法檢驗。

2? 結果

2.1? 各組HepG2細胞IRAK-1蛋白表達水平比較

四組IRAK-1蛋白表達水平結果顯示，A組水平最低，B組水平最高，組間差異有統計學意義（P<0.05）。進一步兩兩比較結果顯示，除了陰性對照組與C組之間差異無統計學意義（P>0.05）外，其他各組間差異均有統計學意義（P<0.05），見表1、圖1。

3? 討論

miRNA是一類非編碼的小RNA分子，在人體的生長發育、炎癥反應、細胞功能及細胞生存周期的調節中發揮重要作用。miRNA穩定的存在于機體細胞中、組織液中以及血漿中，能夠調節蛋白的表達，在病理生理情況下，細胞中的miRNA因消耗會表達減少，也會因細胞凋亡等機制釋放如血漿[8-9]，通過對miRNA功能的研究能夠明確闡述細胞炎癥反應及細胞功能異常的機制。

miR-146a-5p是miRNA成員之一，研究表明在機體炎癥反應過程中，其具有免疫調節的作用，發揮抑制炎癥的作用[10-11]。研究證實，在炎癥反應過程中，其表達水平能夠發生顯著變化，通過分子研究表明，其在抗炎方面作用顯著，包括促進炎癥修復，以及抑制慢性炎癥作用[12-13]。研究證實，高糖環境下機體長期處于慢性的低度炎癥反應狀態，炎癥反應過程能夠加速線粒體的損傷并進一步促進胰島細胞的凋亡，同時減少胰島素分泌引起患者高血糖的發生。炎癥還能夠減少外周肌肉及脂肪組織對于糖的代謝及利用，使機體產生胰島素抵抗[14]。還有實驗在糖尿病模型小鼠的胰島細胞內進行，研究顯示高糖環境下小鼠胰島細胞內miR-146a-5p的表達水平顯著高于非糖尿病小鼠模型，進一步證實了在炎癥刺激情況下，miR-146a-5p的過量表達是進一步發揮抑制炎癥反應的作用。

IRAK-1是一類炎癥反應因子，具有放大和擴大炎癥反應的作用，人IRAK-1基因位于Xq28位點，在細胞炎癥免疫過程中通過激酶激活一系列炎癥因子，并且誘發下游炎癥因子產生瀑布式的炎癥級聯反應，造成細胞產生嚴重的炎癥，影響細胞功能并產生組織損傷[16]。國外的研究顯示，在IRAK-1基因敲除小鼠進行試驗，發現敲除后小鼠膿毒血癥及腦髓炎這類炎癥反應的發生率降低，進一步證明小鼠體內IRAK1因子降解是機體防止炎癥反應過度表達的非常重要的防護調節機制，在實驗過程中也檢測到其相關的炎癥因子表達降低，證明抑制IRAK-1表達能夠減緩細胞的炎癥反應強度[17-18]。但miR-146a-5p是否對HepG2細胞中的IRAK-1蛋白表達產生一定的抑制作用未見報道；在P.gLPS誘導的HepG2細胞炎癥反應是否IRAK-1表達水平會發生變化未見報道；在P.gLPS所誘導的HepG2細胞炎癥反應中，miR-146a-5p是否仍能抑制IRAK-1蛋白表達未見報道。本研究顯示miR-146a-5p能夠顯著抑制HepG2細胞中IRAK-1蛋白表達；P.gLPS刺激能夠顯著增加HepG2細胞IRAK-1蛋白表達；在P.gLPS刺激HepG2細胞產生的炎癥反應中，miR-146a-5p能夠通過抑制細胞IRAK-1蛋白表達發揮抑制炎癥的作用。

本實驗證實在肝HepG2細胞中，miR-146a-5p通過抑制IRAK-1蛋白表達發揮抑制炎癥的作用，證實其在炎癥反應過程中發揮重要作用，本實驗為miR-146a-5p相關細胞中的作用機制研究提供理論依據。

4? 參考文獻

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[2022-12-26收稿]