復方土茯苓顆粒對急性痛風性關節炎兔的抗炎作用

李靜， 黃輝， 武鵬， 孫維峰

（中國人民解放軍南部戰區總醫院，廣東廣州 510010）

痛風性關節炎是由于尿酸鹽沉積在軟骨、骨質、滑囊、關節囊和其他組織中引起的炎性反應[1]。目前，臨床上治療痛風性關節炎急性期的藥物主要有秋水仙堿、非甾體抗炎藥、糖皮質激素等[2]，然而，長期服用極易引起肝腎功能受損、胃腸道反應，且癥狀反復發作[3]。而中醫藥因其價廉、效專、副作用少等優點受到廣泛青睞[4]。復方土茯苓顆粒為本研究組孫維峰教授經驗方研制而成的軍隊醫院非標準制劑，已獲得國家發明專利（專利號：ZL2007100323.3），該藥以利濕泄濁、化痰祛瘀為治則，在臨床上使用10 余年治療高尿酸血癥及痛風性關節炎間歇期具有較好的療效[5-6]。為進一步觀察復方土茯苓顆粒對痛風性關節炎的治療效果，為其臨床合理應用提供參考，本研究以急性痛風性關節炎兔模型為研究對象，觀察復方土茯苓顆粒的干預作用及機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 56 只普通級雄性新西蘭兔，4 ～5 周齡，體質量1.83～2.3 kg，動物質量合格證號：0023116，購自青島康大生物科技有限公司，動物生產許可證號：SCXK（魯）2012-0005。飼養在廣東萊恩醫藥研究院有限公司實驗動物中心，飼養環境為23 ℃、60%相對濕度、12 h 循環照明，自由進食和飲水。實驗方案經廣東萊恩醫藥研究院有限公司IACUC的同意和認可。

1.2 藥物與試劑 復方土茯苓顆粒（中國人民解放軍南部戰區總醫院生產，批號：140601）；秋水仙堿片（西雙版納藥業有限責任公司生產，批號：150431）；痛風舒膠囊（青海綠色藥業有限公司生產，批號：150101）。羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，江蘇永華精細化學品有限公司，批號：20120220）；尿酸鈉（美國Sigma公司）；硫酸多黏菌素B[格雷西亞（成都）化學技術有限公司]；兔抗白細胞介素（IL）-1β、IL-8 酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（大連泛邦化工技術開發有限公司）。

1.3 儀器 XT-2000iv型血液分析儀（日本希森美康株式會社）；ASP300S 全自動組織脫水機、EG1150H石蠟包埋機、RM2016切片機、HI1210攤片機、HI1220 烘片機、DM3000（ebp100-04-L 熒光）型生物顯微鏡、病理圖像分析系統DFC450+圖像采集軟件Leica Application Suite V4（德國Leica公司）；Elx808型酶標儀（美國BioTek公司）。

1.4 藥物制備 尿酸鈉，用生理鹽水配制成2.5%尿酸鈉溶液。硫酸多黏菌素B，用生理鹽水配制成10 U/mL工作液。參考《藥理實驗方法學》[7]，復方土茯苓顆粒成人臨床擬用量為每次1.5 g，每天2次口服，即3 g·d-1·人-1，按體表面積折算兔的等效劑量為0.14 g 藥粉（2.45 g 生藥）/kg。根據上述依據設定復方土茯苓顆粒低、中、高組劑量分別為0.14、0.28、0.56 g/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當于成人臨床日擬用量（3 g）的1、2、4倍。設陽性對照藥物秋水仙堿劑量為0.093 mg/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當于成人臨床預防日擬用量（1 mg·d-1·人-1）的2 倍。設陽性對照藥物痛風舒膠囊劑量為0.336 g/kg，按體表面積等效劑量折算法折算，約相當于成人臨床日擬用量（3.6 g·d-1·人-1）的2倍。復方土茯苓低、中、高劑量組，秋水仙堿組，痛風舒組，分別用0.5%CMC-Na溶液適配制成濃度分別為0.028、0.056、0.112 g/mL，0.018 6 mg/mL，0.067 2 g/mL的混懸液。

1.5 動物分組、給藥與造模 將新西蘭兔隨機分為7組，分別為正常組、模型組、秋水仙堿組、痛風舒組及復方土茯苓低、中、高劑量組，每組8 只。動物劑量根據成人劑量以體表面積換算法換算，給藥容積為5 mL/kg。各給藥組按設定要求灌胃給藥，正常組、模型組給予灌胃等體積的0.5%CMC-Na溶液，每日1次，連續9 d。第9天給藥后1 h，除正常組外，其余各組進行急性痛風性關節炎造模，方法參考MeCarty 研究[8]：造模前用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉兔，將兔左膝關節周圍脫毛并消毒皮膚，輕彎左膝關節后向關節側方進針，將2.5%尿酸鈉溶液0.4 mL（10 mg）和多黏菌素B 溶液0.1 mL（10 U/mL）注入關節腔，以對側關節囊鼓起為注入成功標準。每組分別在造模前（0 h）和造模后2、4、5 h，測量左膝關節同一部位的周長，測量3次，取平均值。

1.6 觀察指標與方法

1.6.1 關節液白細胞計數及IL-1β、IL-8 含量測定 以3%戊巴比妥鈉溶液麻醉放血處死動物，切取膝關節（脛腓骨上1/3段至股骨下1/3骨段，去除關節周圍的肌肉等硬組織，保留完整的關節囊），用0.9%氯化鈉注射液1 mL 灌洗關節腔，收集關節液，離心取上清液分裝于EP 管中，部分用于進行白細胞計數，其余上清液于-80 ℃保存。應用血液分析儀測定白細胞數目。按ELISA 試劑盒說明書測定IL-1β 和IL-8 水平，使用酶標儀于450 nm 波長處測定吸光度值，繪制標準曲線，計算IL-1β、IL-8含量。

1.6.2 HE 染色法觀察滑膜組織病理學變化 將滑膜組織以多聚甲醛溶液固定后，3%硝酸脫鈣8 d，用0.1%氨水中和1 h，梯度乙醇脫水；二甲苯透明，石蠟包埋；切片后，用蘇木素和伊紅對切片進行染色；最后在顯微鏡下觀察并采圖。

1.7 統計方法 應用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析。各組采用Student-T檢驗（配對T檢驗）與給藥前進行比較統計；各實驗組進行組間比較之前先進行組間方差分析（F檢驗）。當組間方差齊同時，組間比較采用Student-T檢驗（非配對的T檢驗）進行統計；組間方差不齊時，采用校正的Student-T檢驗進行統計分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 復方土茯苓顆粒對急性痛風性關節炎兔左膝關節腫脹度的影響 表1 結果顯示：與正常組比較，模型組兔左膝關節腫脹度增加，造模后2 h腫脹度達到高峰（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組的左膝關節腫脹度得到不同程度減小，其中秋水仙堿組、痛風舒組和復方土茯苓中、高劑量組造模后4 h膝關節腫脹程度明顯降低（P＜0.05）。表明復方土茯苓顆粒可明顯緩解急性痛風性關節炎兔膝關節腫脹。

表1 各組兔左膝關節腫脹度比較Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

表1 各組兔左膝關節腫脹度比較Table 1 Comparison of joint swelling in left knee among various groups of rabbits （，cm）

注：①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組秋水仙堿組痛風舒組復方土茯苓低劑量組復方土茯苓中劑量組復方土茯苓高劑量組造模后5 h 9.48±0.08 9.96±0.13①9.80±0.11 9.81±0.08 9.82±0.13 9.82±0.08 9.78±0.08兔數/只8888888造模前（0 h）9.52±0.13 9.44±0.05 9.48±0.04 9.48±0.08 9.50±0.09 9.46±0.08 9.50±0.08造模后2 h 9.46±0.05 10.19±0.15①9.86±0.11②9.98±0.19 10.03±0.20 10.00±0.17 9.90±0.16②造模后4 h 9.48±0.04 10.07±0.11①9.80±0.17②9.82±0.11②9.90±0.12 9.84±0.09②9.80±0.09②

2.2 復方土茯苓顆粒對急性痛風性關節炎兔關節炎癥的影響

2.2.1 各組兔關節液白細胞計數比較 圖1 結果顯示：與正常組比較，模型組關節液白細胞計數顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組關節液白細胞計數未見顯著性差異（P＞0.05），但各給藥組白細胞計數均有降低的趨勢，以復方土茯苓高劑量組降低效果最明顯。

圖1 各組兔關節液白細胞計數比較Figure 1 Comparison of white blood cell count in joint fluid among various groups of rabbits（）

2.2.2 各組兔關節液炎癥因子IL-1β、IL-8 水平比較 圖2結果顯示：與正常組比較，模型組兔關節液中IL-1β、IL-8 水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，各給藥組兔關節液中IL-1β、IL-8水平明顯降低，其中，復方土茯苓高劑量組、秋水仙堿組、痛風舒組差異有統計學意義（P＜0.05）。提示復方土茯苓顆粒可顯著抑制急性痛風性關節炎兔膝關節液中炎癥細胞因子的產生。

圖2 各組兔關節液炎癥因子IL-1β、IL-8水平比較（）Figure 2 Comparison of the levels of inflammatory cytokines IL-1β and IL-8 in the joint fluid among various groups of rabbits（）

2.3 復方土茯苓顆粒對急性痛風性關節炎兔滑膜組織病理學形態的影響 圖3結果顯示：正常組滑膜細胞呈扁平上皮樣，滑膜細胞層下未見炎細胞浸潤，深層纖維組織未見明顯異常；模型組可見大量炎細胞浸潤，并向深層組織蔓延，主要為淋巴細胞和嗜酸性粒細胞；秋水仙堿組及復方土茯苓中劑量組可見局部有一些炎細胞浸潤，少量向深層組織蔓延；痛風舒組可見大量炎細胞浸潤，少量向深層組織蔓延；復方土茯苓低劑量組可見大量炎細胞浸潤，并向深層組織蔓延；復方土茯苓高劑量組可見少量炎細胞浸潤，未向深層組織蔓延。可見，秋水仙堿組、痛風舒組及復方土茯苓高劑量組滑膜組織炎性細胞浸潤和增生較模型組均有不同程度的減輕，其中，復方土茯苓高劑量組改善效果最明顯。

圖3 各組兔滑膜組織病理學形態比較（HE染色，×100）Figure 3 Comparison of synovial histopathological morphology among various groups of rabbits（HE staining，×100）

3 討論

尿酸鈉致兔急性痛風性關節炎是經典的痛風性關節炎模型。兔是解熱、抗炎試驗首選動物，白色兔的炎癥反應較為劇烈，因此，本研究選用新西蘭兔。因藥理劑量的雌激素有抗炎與免疫的抑制作用，故選擇雄性動物進行試驗[9]。有研究[10]顯示，痛風性關節炎是中性粒細胞介導的炎癥，中性粒細胞與內皮細胞粘連是急性痛風產生的本質。體內尿酸鈉晶體作用于血小板、中性粒細胞、滑膜細胞、單核細胞，刺激細胞釋放多種炎癥介質引起痛風性關節炎的發生，其中IL-1β、IL-8 作為炎癥趨化因子和激活因子在痛風性關節炎的發生、發展過程中起重要作用[11]。本研究通過建立兔痛風性關節炎模型主要是考察炎癥反應情況，取兔關節腔灌洗液檢測白細胞和炎癥因子IL-1β、IL-8等炎癥因子指標，并觀察滑膜組織病理情況。因有必要排除由于內毒素等因素引起的炎癥所造成的炎癥因子升高，而多粘菌素B是針對革蘭陰性菌的窄譜抗生素，主要用于局部給藥，如燒傷創面等，其全身吸收性差，口服不吸收，局部用藥對動物影響較小，因此，本研究選用多粘菌素B作為輔助抗生素添加[9]。

復方土茯苓顆粒是本院孫維峰教授根據嶺南地區高尿酸血癥患者的病機特點及臨床治療經驗研制出的中藥制劑。方中土茯苓為君藥，健脾除濕，泄濁解毒，通利關節；萆薢助君藥分清泄濁、祛風濕，為方中臣藥；佐使藥王不留行活血通絡利水，山慈菇能清熱解毒、消癰散結，牛膝活血通經、利尿通淋，引萆薢、土茯苓等藥到達下焦，從而瀉體內痰濕瘀血等濁邪于體外。全方共奏利濕泄濁、化痰祛瘀之功。該方降尿酸的療效已得到臨床及動物實驗的證實[12-15]。本課題組前期現究在細胞水平發現，復方土茯苓顆粒含藥血清可通過上調大鼠滑膜細胞miR-146a 的表達，抑制IL-1β/IL-6，從而緩解炎癥反應[16]。為進一步探討復方土茯苓顆粒的抗炎作用，本課題組構建了尿酸鈉誘導的急性兔痛風性關節炎模型，觀察其對炎癥反應的影響。

本研究結果顯示，與正常組比較，模型組兔左膝關節明顯腫脹，關節液白細胞計數顯著升高，關節液IL-1β、IL-8水平顯著升高，滑膜組織病理學結果可見，膝關節囊內滑膜表面及滑膜細胞下層炎細胞分布密集，主要為淋巴細胞和嗜酸性粒細胞，并向深層纖維組織蔓延的趨勢，表明痛風性關節炎兔模型構建成功。經過預防性給藥后，秋水仙堿組和復方土茯苓高劑量組膝關節腫脹程度較模型組明顯降低（P＜0.05），復方土茯苓中、高劑量組關節液白細胞計數與模型組比較有降低趨勢，復方土茯苓高劑量組、秋水仙堿組、痛風舒組兔關節液中IL-1β、IL-8水平較模型組明顯降低（P＜0.05），秋水仙堿組、痛風舒組及復方土茯苓中、高劑量組滑膜組織炎性細胞浸潤和增生較模型組均有不同程度的減輕，其中，復方土茯苓高劑量組改善效果最明顯。表明復方土茯苓可一定程度地抑制痛風性關節炎兔的炎癥反應，以高劑量效果最佳。在減低膝關節腫脹度方面，復方土茯苓顆粒的療效與秋水仙堿相當，在抑制炎癥因子、減輕滑膜炎癥方面，復方土茯苓顆粒的療效與秋水仙堿和痛風舒膠囊均相當，而在減少關節液白細胞聚集方面，復方土茯苓顆粒的療效優于秋水仙堿和痛風舒膠囊。

綜上所述，復方土茯苓顆粒有一定的抗急性痛風性關節炎作用，可明顯減輕急性痛風性關節炎兔關節腫脹，降低關節液白細胞數量及IL-1β、IL-8水平，改善滑膜炎癥，以高劑量效果為最佳。