缺氧狀態下AH患兒通過調節DC功能加重AR免疫反應及機制研究*

林超萍 雷旭艷 唐雋 仇穎妍 王凱

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是最常見的慢性上呼吸道過敏性疾病之一，由于機體接觸變應原IgE 介導的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，我國患病率為8%～21.4%，該疾病的大流行給患者和社會帶來了沉重的負擔，并影響其生活質量[1]。腺樣體為咽扁桃體，位于鼻咽頂后壁的淋巴組織，參與咽淋巴環，是呼吸道的一道重要的免疫防御門戶，在嬰幼兒早期參與機體的免疫調節反應，一般10 歲以后開始逐漸退化萎縮，而腺樣體肥大（adenoid hypertrophy，AH）可堵塞鼻咽部，引起鼻竇炎、中耳炎、心肺功能改變等臨床癥狀，甚至影響兒童的額面部骨骼發育、性格形成和智力發育等[2]。研究表明AR 是AH 的主要原因[2-3]，而缺氧狀態下AH是否能夠加重AR 免疫反應及機制尚不清楚。樹突狀細胞（dendritic cell，DC）是功能最強的抗原提呈細胞，在免疫應答中發揮著重要作用，可分為髓樣DC 和漿細胞樣DC 等不同特異性DC 亞群，參與維持氣道炎癥、調節T 細胞免疫應答和免疫耐受等作用，誘發氣道變應性炎癥反應和免疫反應，而白細胞介素-17 受體B（human interleukin-17 receptor B，IL-17RB）、白細胞介素-33（human interleukin-33，IL-33）及其受體（ST2）、胸腺基質淋巴細胞生成素（thymic stromal lymphopoietin，TSLP）的受體（TSLPR）的表達可反映DC 的功能[4-5]。目前已有研究表明低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1，HIF-1α）可激活DC 功能而加重AR 的Th2 介導的免疫反應，Th2 細胞分泌白細胞介素-4（IL-4）、白細胞介素-5（IL-5）和白細胞介素-17（IL-17）等細胞因子，促進嗜酸性粒細胞反應和IgE 分泌，并產生抗炎作用，可誘導免疫反應[6-7]。因此，本研究擬分析AH 患兒及AH 合并AR 患兒HIF-1α 表達、DC 功能（IL-17RB、ST2 和TSLPR）、Th2 相關因子（IL-4、IL-5和IL-17）表達，并探討AH 合并AR 患兒HIF-1α與Th2 相關因子的相關性，為指導AR 的診斷及治療提供重要的基礎試驗證據。

1 資料與方法

1.1 一 般資料 選擇2018 年1 月-2020 年12 月佛山市第一人民醫院鼻科診治的100 例AH 患兒進行前瞻性研究。納入標準：（1）AH 患兒符合睡眠時出現響亮的鼾聲，伴有呼吸暫停、憋氣等癥狀，經纖維鼻咽鏡檢測為AH，其中腺樣體/鼻腔比值＞0.6；（2）AR 診斷符合2 項及以上臨床癥狀：鼻塞、清水樣涕、噴嚏、鼻癢癥等，且每天累計1 h 以上或癥狀持續性，皮膚點刺試驗陽性，血清IgE＞0.35 kU/L。排除標準：（1）鼻腔狹窄、鼻中隔偏曲、藥物性鼻炎、感染性鼻炎；（2）患有免疫功能低下的疾病，如先天性免疫球蛋白缺陷等。根據是否伴有AR 將患兒分為AH 組40 例（單純性AH 患兒），AH 合并AR 組60 例（AH 合并AR 患兒），同期選擇對照組50 例（健康對照兒童）。所有AH 患兒均在全麻下進行腺樣體切除術，留取鼻腔黏膜腺樣體部分標本，抽取所有研究對象血液標本待用。對照組兒童在鼻內鏡下檢查時鉗取少許鼻咽淋巴組織標本。本研究通過本院醫學倫理委員會批準，所有研究對象家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用美國BD FACSAria Ⅲ流式細胞儀，全自動多功能酶標儀購自德國BMG 公司，HIF-1α 試劑盒購自美國R&D 公司（貨號：RDC3272）；IL-4、IL-5 和IL-17 試劑盒購自美國R&D 公司，貨號分別為D4050、D5000B 和D1700。IL-17RB、ST2 和TSLPR 抗體購自美國R&D 公司貨號分別為AF1207、AF523 和FAB5461P。

1.2.2 酶聯免疫吸附試驗（ELISA）將鼻腔黏膜組織腺樣體標本切碎，勻漿后，稀釋離心取上清液，提取蛋白；血液標本離心后留取血清液待測量。采用ELISA 法檢測三組腺樣體組織勻漿后的上清標本和血清中HIF-1α 和Th2 相關因子（IL-4、IL-5 和IL-17）表達。

1.2.3 流式分析術 采用密度梯度離心法分離出外周血單核細胞（PBMCs），采用CD14 免疫磁珠篩選單核細胞，將其置于含有重組人單核細胞集落刺激因子和IL-4 的培養基中培養，取細胞置于懸液中，PE 標記的IL-17RB、APC 標記的ST2 和Alexa Fluor 700 標記TSLPR 抗體孵育30 min，PBS 漂洗后加入相應二抗孵育，加入流式懸液，于流式細胞儀檢測髓系DC 中IL-17RB、ST2 和TSLPR 的表達水平。

1.3 統計學處理 采用SPSS 21.0 軟件進行統計學分析，計數資料采用（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用Bonferroni 法；采用Pearson 分析HIF-1α 與Th2 相關因子的相關性。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AH 合并AR 組、AH 組和對照組一般資料比 較 AH 合并AR 組男35 例，女25 例；年齡5～9 歲，平均（7.48±1.37）歲。AH 組男20 例，女20 例，年齡6～9 歲，平均（7.27±1.53）歲。對照組男27 例，女23 例；年齡6～11 歲，平均（7.87±2.72）歲。三組一般資料比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 三組HIF-1α 表達水平比較 AH 合并AR 組、AH 組血液和鼻黏膜中的HIF-1α 水平均高于對照組，且AH 合 并AR 組均高 于AH 組（P＜0.001），見表1。

表1 三組HIF-1α表達水平比較[pg/mL，（）]

表1 三組HIF-1α表達水平比較[pg/mL，（）]

*與對照組比較，P＜0.05；#與AH 組比較，P＜0.05。

2.3 三組IL-17RB、ST2 和TSLPR 比較 與對照組比較，AH 合并AR 組、AH 組DC 中IL-17RB、ST2和TSLPR 的表達均明顯升高，且AH 合并AR 組均高于AH 組（P＜0.05），見表2。

表2 三組IL-17RB、ST2和TSLPR比較[%，（）]

表2 三組IL-17RB、ST2和TSLPR比較[%，（）]

*與對照組比較，P＜0.05；#與AH 組比較，P＜0.05。

2.4 三組Th2 相關因子比較 與對照組比較，AH 合并AR 組、AH 組血液和鼻黏膜Th2 相關因子（IL-4、IL-5 和IL-17）的表達均明顯升高，與AH 組比較，AH 合并AR 組均較高（P＜0.001），見表3。

表3 三組Th2相關因子比較[pg/mL，（）]

表3 三組Th2相關因子比較[pg/mL，（）]

*與對照組比較，P＜0.05；#與AH 組比較，P＜0.05。

2.5 AH合并AR患兒HIF-1α 的表達水平與Th2 相關因子的相關性分析 血清和鼻黏膜的HIF-1α 與IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相關（P＜0.05），見表4。

表4 AH合并AR患兒HIF-1α的表達水平與Th2相關因子的相關性分析

3 討論

AR 是特應性個體接觸變應原后，由免疫球蛋白IgE 介導，多種免疫活性細胞參與的鼻黏膜非感染性慢性炎癥性疾病。AH 可阻塞呼吸道，表現為口呼吸、流鼻涕、打鼾、睡眠呼吸暫停和低鼻音等癥狀，手術切除是治療該病的重要方式。AH 和AR是兒童常見病和多發病，兩者可能同時存在，并可能引起相似的臨床癥狀[8-10]。研究表明AR 是AH增生的主要因素，而在缺氧狀態下AH 能否加重AR 的免疫反應尚缺乏充足的證據。闡明AH 缺氧狀態對DC 功能的影響及其在AR 發病中的變應性炎癥機制的作用，研究針對靶向DC 亞群細胞的治療新策略是具有重要意義的。

HIF-1α 是一種反映機體缺氧狀態的敏感性因子，在缺氧狀態下，HIF-1α 的表達升高[11-12]。另有研究探討AR 患兒存在細胞凋亡，其機制與Ras激活MAPK-HIF-1α 通路有關，但目前尚無系統性研究探討AH 合并AR 患兒的HIF-1α 與Th2 相關因子的相關性[13]。本研究發現，與對照組比較，AH 組和AH 合并AR 組的HIF-1α 水平均明顯升高，且AH 合并AR 組升高更為明顯，表明AH 為慢性狀態，可持續較長時間，常伴有部分或完全的鼻功能損害，導致口腔呼吸繞過鼻咽部有限的空氣通道，造成慢性間歇性缺氧，同時AH 伴隨AR 患兒缺氧更為明顯。

白細胞介素-25（IL-25）、IL-33 和TSLP 是Th2 免疫反應發展過程中上皮細胞和DC 之間聯系的基礎，通過激活DC 成熟分化，刺激Th2 細胞活化，從而增強Th2 免疫應答[5，14-15]。另外，既往研究提示AR 患者骨髓DC 表達較高水平的IL-17RB、ST2 和TSLPR，與其介導的嗜酸性粒細胞性炎癥反應有關[4-5]，并與AR 疾病嚴重程度相關，與Th2 水平呈正相關[4]，但上述研究尚未分析AH 患兒的缺氧指標變化及其合并AR 患者DC 功能指標變化。本研究發現，與對照組比較，AH 患兒和AH 合并AR 患兒的IL-17RB、ST2 和TSLPR 水平明顯升高，且AH 合并AR 患兒升高更為明顯，表明AH 患兒或AH 合并AR 患兒觸發IL-17RB、ST2 和TSLPR信號通路從而激活DC 的功能在免疫應答中發揮著重要的作用。

Th2 免疫反應在AH 合并AR 患兒中發揮著重要作用，其可能通過釋放IL-4、IL-5 和IL-17 等細胞因子觸發免疫反應[16-18]。本研究中，與對照組比較，AH 組和AH 合并AR 組的IL-4、IL-5 和IL-17水平明顯升高，且AH 合并AR 組升高更為明顯；相關性分析提示，AH 合并AR 患兒HIF-1α 水平與IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相關。基于上述研究結果，筆者推測AH 患兒導致慢性缺氧癥狀，其鼻黏膜組織中HIF-1α 升高，誘發AR 的Th2 介導的免疫反應，主要機制是變應原刺激上皮細胞激活DC，釋放趨化因子，募集血管內單核細胞進入氣道上皮，從而分化為炎癥性DC，同時DC 可調節T細胞活化，向Th2 和Th17 分化，促進B 細胞分化及合成IgE，可產生Th2 細胞因子（IL-4、IL-5 和IL-17）和趨化因子，導致氣道嗜酸性粒細胞、肥大細胞和Th2 細胞浸潤。研究提示，AH 合并AR患兒的病理機制可能與優勢組織嗜酸性粒細胞增多和Th2 介導的炎癥反應有關，但尚未探討其與DC 功能的相關性[19-20]，而本研究考慮其可能機制為DC 介導T 細胞活化，為該病的機制研究提供了更為全面的證據。本研究為單中心小樣本量的研究，且本研究僅為AH 及AH 合并AR 患兒缺氧指標、免疫相關指標檢測及相關性分析，尚未進行功能性試驗驗證其具體機制，今后需進一步多中心、擴大樣本量的研究，且在相應的細胞模型進行功能性實驗。

綜上，AH 患兒和AH 合并AR 患兒，存在HIF-1α、IL-17RB、ST2、TSLPR、IL-4、IL-5 和IL-17 的升高，且AH 合并AR 患兒HIF-1α 水平與IL-4、IL-5 和IL-17 均呈正相關，提示AH 患兒存在缺氧狀態，可能引起DC 功能激活，觸發Th2介導的免疫反應。在臨床上，對AH 患兒，應積極治療腺樣體的肥大和增生，改善其缺氧狀態，從而減輕AR 的Th2 免疫應答反應，可達到改善AR 的過敏免疫反應。