張立富,韓日疇,李文峰*

(1. 華南農業大學植物保護學院,廣州 510640;2. 廣東省科學院動物研究所,廣東省動物保護與資源利用重點實驗室,廣東省野生動物保護與利用公共實驗室,廣州 510260)

狄斯瓦螨Varroadestructor原是東方蜜蜂Apiscerana身上的寄生蟲,后轉移到西方蜜蜂Apismellifera身上,主要以幼蟲、蛹及成蜂脂肪體為食獲取營養(Ramseyetal., 2019),是目前世界養蜂業的主要寄生害蟲。培育具有抗螨特性的蜂種被認為是可持續的狄斯瓦螨防治方法。瓦螨敏感衛生行為(Varroasensitive hygiene, VSH)是一種蜜蜂活躍的狄斯瓦螨抵抗機制,具有VSH行為的蜂群能夠檢測并清除更多感染蜂螨的蜜蜂后代,使蜂群狄斯瓦螨種群數量降低至蜂群受害閥值以下(Harbo and Harris, 2009)。瓦螨敏感衛生行為的表達受環境、化學和分子等諸多因素調控。通過雜交遺傳育種可獲得具有VSH的抗螨蜂種(Harbo and Harris, 2001; Genersch and Aubert, 2010)。本文圍繞近年來蜜蜂瓦螨敏感衛生行為的行為特征、調控機制及抗性育種應用等相關研究進行綜述,并展望了未來的研究方向。

1 狄斯瓦螨的生活周期及其對蜜蜂的危害

1.1 狄斯瓦螨生活周期

雄性狄斯瓦螨生活周期較短,交配后不久便會死亡。雌性狄斯瓦螨的生活周期很長(David De Jong, 1982),可劃分為在幼蟲巢房內的繁殖期(Reproductive phase)和在成年蜜蜂身上的游離期(Phoretic phase) (Piouetal., 2016)。狄斯瓦螨在意蜂工蜂巢房封蓋前15～20 h和雄蜂巢房封蓋前40～50 h入侵巢房(Garridoetal., 2013),標志著蜂螨進入繁殖期。成年的雌性蜂螨會在蜂蛹第二節腹板間開一個孔以供其和后代共同取食蜜蜂脂肪體(Ramseyetal., 2019)。巢房入侵后60～70 h開始產第一粒雄卵,之后每隔30 min產1粒雌卵,雌螨一生有3～7個產卵周期,最多可產 30粒卵(劉川冬等,2017)。雌性蜂螨及其后代隨蜜蜂發育成熟一同出房(Donzé and Guerin, 1994),狄斯瓦螨進入游離期。游離期即隨宿主蜜蜂一同出房的雌性蜂螨在成年蜜蜂身上生活直至進入下一個繁殖期為止,它們附著在蜜蜂身上,吸食蜜蜂的脂肪體,借助蜜蜂之間物理接觸寄生新的宿主蜜蜂,尋找入侵育雛巢房繁殖的機會。雌性蜂螨能夠通過蜜蜂表皮烴類物質識別并優先寄生哺育蜂,利用哺育蜂哺育幼蟲借機入侵幼蟲巢房(Ricklietal., 1994);還能夠通過脂類化合物氣味(Boecking and Spivak, 1999)和幼蟲表皮CHCs(Lietal., 2021)來選擇雄蜂幼蟲巢房。

1.2 狄斯瓦螨對蜜蜂的危害

1.2.1對蜜蜂個體的危害

有研究表明,被狄斯瓦螨寄生的工蜂羽化后平均體重比健康工蜂輕6.3%～25%,平均體重損失比例與被寄生的狄斯瓦螨數量呈正相關,僅1只雌螨寄生,就會導致工蜂體重下降7%,雄蜂體重下降10% (De Jongetal., 1982);可見狄斯瓦螨的取食會影響蜜蜂健康,導致蜜蜂的體重下降(Weinberg and Madel, 1985; BowenWalker and Gunn, 2010; Richardsetal., 2011; Annosciaetal., 2012)。狄斯瓦螨協同蜜蜂殘翅病毒(Deformed Wing Virus, DWV)會導致蜜蜂的壽命縮短(Richardsetal., 2011; 李文峰, 2020)。此外,狄斯瓦螨侵染發育中的雄蜂會導致其飛行能力下降、精子量減少(Duayetal., 2002),嚴重時則導致巢房內雄蜂死亡(Boecking and Spivak, 1999)。有研究認為狄斯瓦螨侵染干擾了蜜蜂神經系統,成年采集蜂被狄斯瓦螨侵染則會導致其學習能力和認知記憶能力下降,方向感不精確,影響采集和返巢;認知能力下降,影響化學信號識別和交流,缺乏對環境刺激的應答能力(Kraljetal., 2007);影響蜜蜂調節水交換的能力(Annosciaetal., 2012),系統免疫能力下降(Richardsetal., 2011)、缺乏酚氧化酶(Gregoryetal., 2005),血淋巴總蛋白含量減少、卵黃蛋白原濃度和脫皮激素含量都發生了顯著的變化(Amdametal., 2004),使蜜蜂抵抗力下降,嚴重影響蜂群越冬的能力(van Dooremalenetal., 2012)。有研究證明,蜜蜂通過取食花粉獲取蛋白質、氨基酸和脂質等營養物質,同時能夠降低蜜蜂對寄生蟲和病原體的敏感性,但瓦螨引起的病毒種群發展和新陳代謝的下降,導致蜜蜂取食花粉的一系列功效難以觸發(Alauxetal., 2011)。

1.2.2對蜂群的危害

狄斯瓦螨還是多種蜜蜂病毒的載體(Gisderetal., 2009),尤其是殘翅病毒(DWV),可在狄斯瓦螨體內繁殖復制后大量傳播給蜂群其他個體(Generschetal., 2010)。蜜蜂病毒單獨存在不會威脅蜜蜂健康;在沒有狄斯瓦螨的地區只有6%～13%的蜂群檢測到DWV病毒,而在狄斯瓦螨侵染地區DWV病毒感染率增加到75%～100%(Martinetal., 2012),說明狄斯瓦螨促進了病毒的傳播(Gisderetal., 2009; Martin, 2010; Santamariaetal., 2018)。有研究發現狄斯瓦螨的唾液蛋白中含有DWV病毒蛋白(Zhang and Han, 2018)。通過取食,狄斯瓦螨直接將DWV病毒注入到蜜蜂體內(Martinetal., 2012; Ryabovetal., 2014)。DWV病毒感染導致發育中的蜜蜂殘翅、抑制細胞免疫并顯著縮短成年蜜蜂的壽命(Richardsetal., 2011),是蜂群越冬死亡的主要病因(Generschetal., 2010; Dainatetal., 2012)。

1.3 狄斯瓦螨防治措施

1.3.1物理防治

狄斯瓦螨的物理防治主要有細粉末處理、熱處理、分蜂處理等,但實際的狄斯瓦螨防治效率較低,且實地上的防治工作難以進行(張祎和韓日疇,2012);有研究證明可通過割除雄蜂巢房的方法來減少蜂群中狄斯瓦螨的數量(Calderone, 2005; Wantuch and Tarpy, 2009),因為狄斯瓦螨偏向于入侵雄蜂育子巢房以增加自己的繁殖力,可以在蜂群中插入雄蜂脾誘殺。物理防治雖然能在一定程度上限制狄斯瓦螨的種群數量,但實際是一個漫長的過程,且防治效率難以達到預期。

1.3.2化學防治

殺螨劑是狄斯瓦螨化學防治中應用較為廣泛的選擇,幾十年間養蜂人使用較多的殺蟲劑有雙甲瞇(Amitraz)、蠅毒磷(Coumaphos)、氟氰胺菊酯(Tau-fluvalinate)、氟氯苯菊酯(Flumethrin),這些殺蟲劑具有成本低、活性強、使用便捷、殺螨率高等特點(Mullinetal., 2010)。此外,有機酸的使用也具有不錯的防治效果,甲酸熏蒸法以及草酸的施用都可以有效防治狄斯瓦螨。但過度依賴和長期使用殺螨劑,會對蜂群造成一定的影響(Tihelka, 2018),會導致工蜂的記憶力、采集能力以及衛生行為能力下降(Rangel and Tarpy, 2015)。影響蜂王和雄蜂的生殖健康(Gashoutetal., 2020)。造成化學殘留,污染蜂產品(Bogdanov, 2005)。且化學藥物的使用會增強瓦螨的化學抗藥性(Rinkevich, 2020)。

1.3.3生物防治

利用昆蟲致病性真菌防治狄斯瓦螨是目前狄斯瓦螨生物防治的有效途徑(Dennisetal., 2008),目前已分離了40種對狄斯瓦螨有抑菌作用的真菌,如輪枝孢菌、被毛孢屬、擬青霉屬、白僵菌Beauveria、綠僵菌Metarhizium和彎頸霉屬等能有效的防治狄斯瓦螨。但對于施用方式和環境具有一定的要求才能有效提高防治效果,且需要養蜂人具備一定的生物學知識支撐,才能有效提高生物防治效果。

1.3.4RNA干擾技術

通過對蜜蜂進行的RNA干擾(RNA interference, RNAi),可借助取食途徑轉移到狄斯瓦螨體內,導致狄斯瓦螨的基因表達被沉默,進而影響其繁殖、降低種群數量(Garbianetal., 2012)。通過RNAi技術鑒定與狄斯瓦螨繁殖相關的基因,發現RpL8、RpL11、RpP0和RpS13這4個基因的dsRNA沒有影響狄斯瓦螨的生命力,但顯著降低了狄斯瓦螨的繁殖能力(Huangetal., 2019)。有研究表明,使用Vd40090基因的dsRNA處理狄斯瓦螨,能夠影響其選擇宿主和取食的能力,以及抑制狄斯瓦螨繁殖相關基因的表達,導致狄斯瓦螨的繁殖率降低(Ngansoetal., 2021)。此外,Leonard等運用基因編輯技術改造了一種共生的蜜蜂腸道細菌Snodgrassellaalvi,該工程菌可以穩定地重新定植蜜蜂并產生雙鏈RNA以激活RNAi途徑,抑制宿主基因表達,從而改變蜜蜂的生理、行為和生長,利用這種方法可以提高蜜蜂的病原體抗性,同時可以通過觸發蜂螨RNAi反應來殺死蜜蜂身上寄生的蜂螨(Leonardetal., 2020)。以上的研究表明基于RNA干擾技術和基因編輯技術改造蜜蜂腸道菌都為狄斯瓦螨防治開辟了新的方法。

2 蜜蜂瓦螨敏感衛生行為及其調控機制

2.1 蜜蜂抗螨行為

2.1.1瓦螨敏感衛生行為

瓦螨敏感衛生行為(Varroasensitive hygiene, VSH)是蜜蜂一種活躍的行為機制,執行VSH的工蜂能對狄斯瓦螨化學線索表現出高度敏感性,相比其他衛生工蜂,更低閥值的狄斯瓦螨化學線索就能觸發它們的瓦螨敏感衛生行為,去檢測并清除感染蜂螨的幼蟲。Harb和Harris研究發現抗螨蜂群的螨蟲繁殖率很低,將該特性命名為抑制瓦螨繁殖(Suppressed mite reproduction, SMR)(Harbo and Harris, 2005)。但是,在后來的研究中發現較低狄斯瓦螨繁殖率是由蜜蜂清除染病幼蟲的行為所致,并將其改名為:瓦螨敏感衛生(Varroasensitive hygiene, VSH)(Harbo and Harris, 2009)。瓦螨敏感衛生行為主要包括檢測、開蓋、染病幼蟲及其身上寄生蜂螨的清除,是通過犧牲后代以降低狄斯瓦螨的繁殖率,降低其種群數量,使蜂群的受害指數降低到安全值以下。具有VSH行為的蜂群相對非VSH蜂群,能夠清除更多被狄斯瓦螨入侵的后代,使得蜂群能夠在狄斯瓦螨侵害的自然環境中長久的存活下來。觸發VSH的因素有多種,衛生工蜂的觸角可能在VSH行為的表達中起關鍵作用,通過對比蜜蜂的觸角轉錄組,發現執行VSH蜜蜂的觸角轉錄組圖譜更接近于哺育蜂而非采集蜂(Mondetetal., 2015)。對比信號化合物的電生理反應,發現VSH蜜蜂的左觸角比右觸角對化合物反應更激烈,而非VSH蜜蜂的左右觸角的電生理反應則基本一致(Mondetetal., 2021)。狄斯瓦螨身上的化學線索是觸發VSH行為的因素之一,VSH蜜蜂依靠檢測狄斯瓦螨化學線索進而觸發VSH行為(Sprauetal., 2021)。被狄斯瓦螨侵染的蜜蜂幼蟲身上的化學信號也是觸發VSH行為的關鍵因素(Wagoneretal., 2018),狄斯瓦螨侵染密度和巢房周圍環境也是觸發蜜蜂VSH行為的潛在因素(Kimetal., 2018)。這些觸發機制可為進一步提高狄斯瓦螨清除率的研究提供方向引導。

2.1.2其他抗螨行為

梳理行為(Grooming behavior)(Pengetal., 1987)被證明可以清除狄斯瓦螨(Pettis and Pankiw, 1998),梳理行為可分為自動梳理(Auto-grooming)和同伴梳理(Allo-grooming),同伴梳理是由一種梳理舞蹈引發的(Boecking and Spivak, 1999)。梳理效率跟梳理行為的強度有關,梳理行為的強度與蜜蜂neurexin-1基因表達有關(Hamiduzzamanetal., 2017)。蜜蜂的衛生行為能夠增加蜂群梳理行為的時間和梳理螨蟲的效率(Kirraneetal., 2018)。

重新封蓋行為(Recapping behavior)即工蜂打開可能染病的幼蟲巢房封蓋子,檢查后再用蜂蠟重新封蓋的行為,由衛生蜂完成(Oddieetal., 2018)。重新封蓋行為不會清除幼蟲,不會影響蜂群的正常繁殖(Rosenkranzetal., 2010)。反復打開和關閉巢房封蓋子會造成巢房內溫度、濕度的變化,狄斯瓦螨對巢房溫度、濕度變化很敏感(Leetal., 1990; Kraus and Velthuis, 1997),蜜蜂重新封蓋行為在不清除感染蜂螨幼蟲的情況下,可以降低狄斯瓦螨的繁殖率(Oddieetal., 2018)。有研究表明與重新封蓋行為相關的基因位于5號染色體上(Guichardetal., 2021)。

此外,雄蜂巢房是一種特殊的抗螨陷阱,狄斯瓦螨更偏向于寄生雄蜂育子巢房,過度寄生會導致雄蜂死亡,意味著失去了食物供應,整個雄蜂巢房內的瓦螨只能全軍覆沒,因為工蜂不會從外面打開雄蜂巢房的封蓋子(Boecking and Spivak, 1999)。蜜蜂能夠調節蜂群空間使用和社交互動來應對狄斯瓦螨侵染和蜜蜂病毒的轉播,被狄斯瓦螨侵染的蜂群,通過增加采集蜂群體與哺育蜂群體間的安全距離和減少個體間交流和接觸來避免可能的傳播(Puscedduetal., 2021),蜂群這種保持社交距離和減少交流和接觸的行為跟人類防控新冠肺炎病毒的策略具有相似性。

2.2 瓦螨敏感衛生行為特征

VSH行為的特征是執行VSH的工蜂通過觸角感受狄斯瓦螨和染病幼蟲相關的信號化合物,打開封蓋子,并將染病幼蟲和狄斯瓦螨清除出巢房(Harbo and Harris, 2009)。VSH行為主要是由哺育蜂來執行(Mondetetal., 2015),很低的化學物質線索即可觸發它們的VSH行為。為了躲避VSH工蜂的檢測,狄斯瓦螨能夠模仿宿主身上的表皮碳氫化合物進行化學偽裝(Katheretal., 2015),使其逃脫衛生工蜂的檢測(Le Conteetal., 2015)。VSH行為是通過清除蜜蜂染病后代來控制狄斯瓦螨的種群數量,越高的清除率意味著清除越多的蜜蜂后代,可能會對蜂群的發展造成一定的損失,降低蜂群的自然抵抗力(Rosenkranzetal., 2010)。蜜蜂VSH行為的特征跟其抗螨機理是研究VSH抗螨特性的關鍵。VSH行為的抗螨機理即執行VSH行為的工蜂開蓋清除感染狄斯瓦螨的蜜蜂幼蟲和蜂蛹,中斷了雌性狄斯瓦螨的繁殖,并將被感染的蜜蜂幼蟲及其身上的雌性蜂螨一同清除掉(Harbo and Harris, 2009)。VSH顯著影響了狄斯瓦螨的繁殖,主要表現為:中斷繁殖螨的繁殖,導致其繁殖失敗并被清除出蜜蜂幼蟲巢房,以及延遲雌性蜂螨的繁殖,導致部分雌螨不繁殖或繁殖的后代在宿主蜜蜂出房前尚未發育成熟,來不及交配而產生不育螨(Le Conteetal., 2010)。

2.3 行為調控機制

雌性蜂螨身上附著的揮發性化學氣味和染病蜜蜂幼蟲相關的化合物是觸發VSH行為的主要因素,可通過選擇相關化合物作為VSH行為的誘導劑,觸發蜂群的VSH行為,提高狄斯瓦螨清除率。同時巢房區域內雌螨的密度和數量也會增加觸發蜜蜂的VSH行為的概率(Rosenkranzetal., 1993)。蜂群的強弱也會影響蜜蜂VSH行為的觸發。幾種抗螨行為之間互作也能提高蜜蜂對狄斯瓦螨的防治效果,梳理行為、重新封蓋行為、VSH行為之間并不是單獨抗螨的機制,彼此之間既是獨立的行為,但又相互關聯,相互促進。

2.3.1化學調控

化學調控出發點是狄斯瓦螨身上的化學線索(Rosenkranzetal., 1993),感染蜂螨幼蟲或蛹及其巢房相關化學信號(Wagoneretal., 2018)。研究證明,染病蜜蜂幼蟲相關的混合信號化合物(Z)-10-三碳聯烯、(Z)-8-十五碳聯烯、(Z)-8-十七烯和(Z)-6-十五烯的混合物在2 h的測試中觸發了衛生行為(Wagoneretal., 2021)。有研究鑒定了這6個瓦螨寄生特異性化合物:TrCO、PCO、TCA、HPCO、HCA和NCO能夠觸發VSH行為(Mondetetal., 2021),為VSH行為誘導劑研發提供了選擇。多種化合物混合使用觸發效率更高,說明VSH行為的觸發是由多種化學信號調控。具有VSH行為的蜜蜂對相關化學物質顯示出左右觸角不對稱的氣味反應,左側觸角產生更強的EAG信號(Mondetetal., 2021)。有研究表明衛生行為的觸發并非只與敏感的嗅覺相關,當瓦螨侵染水平達到臨界值時衛生行為就會被觸發,只是VSH蜂群的這個臨界值較低(Le Conteetal., 2011)。

2.3.2分子調控

蜜蜂基因組測序工作為從分子水平進一步研究蜜蜂的抗螨機制提供了重要基礎。研究發現hex110基因在中蜂中表達上調,在意大利蜜蜂Apismelliferaligustica中表達下調,NPY-r基因在2種蜜蜂中表達下調外,2種蜜蜂的差異表達基因均不同,說明分子調控在不同蜂種中存在差異(Zhangetal., 2010)。通過分析大腦轉錄組,發現共有39個轉錄本在高VSH和低VSH蜜蜂的大腦中差異表達,其中高VSH顯著上調的有14個,下調的有25個(Le Conteetal., 2011)。發現差異表達的Dscam基因的3個外顯子在高VSH中持續下調,其對于調節軸突引導和神經元連接是必不可少的(Chenetal., 2006)。氣味結合蛋白3(Obp3)最初被描述為嗅覺組織中氣味分子的載體,首先在果蠅觸角研究中被認為與氣味轉換有關,它的下調可能在VSH蜜蜂的嗅覺敏感性中起到支持作用;同時,在果蠅嗅覺基因表達中可能解釋嗅覺行為的候選基因Ets65A的下調,表明VSH蜜蜂表達的氣味引導行為水平與其他蜜蜂不同(Le Conteetal., 2011)。

2.3.3其他

蜂群強弱會影響蜜蜂的VSH行為;關聯性相近的行為之間會相互促進,如衛生行為和VSH行為能夠引發更長時間的梳理行為,導致更多雌性蜂螨和染病幼蟲被清除。不同的行為之間相互作用,彼此間能產生積極的促進作用(Kirraneetal., 2018)。環境、氣候、溫度等因素也是影響VSH的因素,有研究表明季節性升溫會加劇秋季蜂群內的狄斯瓦螨侵害水平,隨著蜜蜂繁殖的增加意味著狄斯瓦螨更多的繁殖概率,狄斯瓦螨種群數量增加則VSH也會隨之增加(Smolińskietal., 2021)。

3 VSH作為抗性性狀在抗螨蜜蜂遺傳育種中的應用研究

抗性蜜蜂的培育被證明是一條可持續的狄斯瓦螨防治道路,增加寄主的耐受性,使狄斯瓦螨和蜜蜂能夠和平共存(Guichardetal., 2020)。西方蜜蜂蜂群深受狄斯瓦螨的危害,歐洲抗性選擇計劃始于20世紀80年代,至今已有近40年的積累(Rindereretal., 2010)。鑒于中華蜜蜂Apiscerana的高抗螨特性,國內蜜蜂繁育工作重心多放在蜜蜂的生態和經濟效益方面,抗螨性狀的培育工作較少。19世紀末開始,養蜂人將不同亞種的蜂群雜交,雜交后大多數蜂群能在狄斯瓦螨的侵染中存活下來,表明抗性是由基因調控的可遺傳的(Büchleretal., 2010)。可通過遺傳育種使后代獲得VSH抗性(Harbo and Harris, 2001)。高VSH蜂王和低VSH蜂王通過混交和回交,可得到不同VSH強度的蜂群(Genersch and Aubert, 2010)。VSH性狀一旦注入到蜂群中,可以通過相對簡單的選擇保持至少幾代(Dankaetal., 2016)。有研究開發了單核苷酸多態(SNP)標記方法,進行基因組測序能夠診斷和評估具有高度衛生行為能力的蜜蜂品系,為抗性育種選擇提供了選擇方法(Kimetal., 2019)。科學的育種工作依賴于具有合適的測試性狀和育種計劃的有效協調,同時要以田間條件測試的遺傳力和實用性為出發點再結合當地實際情況綜合考慮(Büchleretal., 2010)。

4 展望

狄斯瓦螨的防治是目前養蜂業的棘手問題,培育抗螨蜂種被認為是未來養蜂業防治狄斯瓦螨的可持續方法,通過培育抗螨的蜂種增加蜜蜂的寄生蟲耐受性,使其和狄斯瓦螨之間達到一種和平共存的水平。蜜蜂的抗性性狀是抗螨蜜蜂培育的最好選擇,已經有研究證明蜜蜂的VSH、梳理行為、重新封蓋行為等都是蜜蜂有效的抗螨性狀?？茖W地檢測、篩選抗性基因是育種工作的基礎。深入探究抗螨性狀的機制能夠幫助人們找到防治狄斯瓦螨的策略。往后的研究重心在于抗螨蜂種的培育工作上,所以抗螨行為的抗性基因和分子調控機制是突破口,培育抗螨的蜜蜂將能夠在未來幫助蜜蜂抵抗狄斯瓦螨的侵害,降低蜜蜂病毒的傳播,提高蜜蜂的生態效益和經濟效益。