不同時期應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對大鼠深Ⅱ度燒傷后增生性瘢痕形成的影響

邢 亮，馮建科，馬磊磊，魏 偉，張慶富，張 涵

（河北醫科大學第一醫院燒傷整形科 河北 石家莊 050000）

瘢痕是皮膚受到各種創傷愈合修復后的自然反應，其異常增生可導致病理性瘢痕。病理性瘢痕可以分為很多種，包括增生性瘢痕(Hypertrophic scar，HS)、淺表性瘢痕和瘢痕疙瘩等[1]。在瘢痕的眾多類型里以HS最為常見而又難以治療，約占91.4%[2]。深Ⅱ度燒傷傷及真皮網層，因此極易發生異常增生，形成HS，給患者帶來經濟和心理負擔，是臨床燒傷科醫師面臨的一大難題[2]。復方肝素鈉尿囊素凝膠內含洋蔥提取液、肝素鈉和尿囊素，具有抑制成纖維細胞的增殖、避免組織硬化、抗炎、增加瘢痕表面有彈力、減少病理性膠原過度增生和促進細胞上皮化的作用，常于創面愈合后立即應用，臨床治療作用明確，但有研究發現部分患者治療效果并不理想[3-4]。瘢痕的增生過程可分為炎癥期（肉芽組織期）、增生期、重塑期（瘢痕成熟期）3個階段[5]。各個階段細胞生長環境不同，藥物作用效果也因應用時間不同可產生巨大的差異。本研究通過制備深Ⅱ度燒傷大鼠模型，觀察不同時期應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對HS的影響，以期發現復方肝素鈉尿囊素凝膠抑制瘢痕增生的最佳時間。

1 材料和方法

1.1 實驗動物：選擇20周齡SPF級SD大鼠50只，購于河北伊維沃生物科技有限公司[動物生產許可證號：SCXK（冀）2020-002]，雌雄不限，體重（250±50）g。分籠飼養于室溫18℃～25℃、濕度50%～60%、12 h光照/12 h黑暗交替和潔凈空氣通風的環境中。定時喂食和更換墊料。所有的處理嚴格遵行《實驗動物管理條例》，并在醫院實驗動物管理委員會監督下進行。

1.2 主要試劑與儀器：復方肝素鈉尿囊素凝膠購于Merz Pharma GmbH & Co.KGaA公司、OCT冰凍切片包埋劑、伊紅、蘇木素、改良Masson三色染色試劑盒和中性樹膠均購于索萊寶公司；TRIZOL購于Thermo Scientific公司；FastKing RT Kit和FastFire qPCR PreMix購于天根生化科技有限公司；實驗儀器和實驗場地由河北醫科大學第一醫院中心實驗室提供。

1.3 方法

1.3.1 實驗模型制備：SD大鼠實驗前1周進行適應性飼養。參照丁毅等[6]報道的方法制備模型：大鼠實驗前1周進行適應性飼養，造模前1 d禁食禁水12 h。使用10%水合氯醛（0.3 ml/kg）腹腔注射麻醉，背部備皮，完全刮干凈毛發后用8%硫化鈉溶液脫毛，75%乙醇消毒。將砝碼放到燒開的水浴鍋中，煮沸10 min，用鑷子將砝碼垂直置于大鼠背部要燙傷的皮膚上，持續10 s后移開砝碼（病理切片觀察是否為深Ⅱ度燙傷），移開砝碼后立即予腹腔注射5 ml生理鹽水，進行抗休克治療。病理切片證實造模成功，切片呈現：部分真皮層內細胞壞死，部分毛囊等附件殘存，毛細血管擴張、管腔可見血液瘀滯及紅細胞。對照組大鼠不作任何處理。見圖1。

圖1 兩組創面皮膚病理切片（100×）

1.3.2 實驗分組：根據復方肝素鈉尿囊素凝膠應用時間分為14 d組（A組）、28 d組（B組）和42 d組（C組）。其中A組又分為應用前對照組（A0組，于造模第14天取材）、未應用組（A1組，于造模第14天應用凡士林，涂抹28 d后取材）、應用組（A2組，于造模第14天應用復方肝素鈉尿囊素凝膠，與A1組同期取材）。B組又分為應用前對照組（B0組，于造模第28天取材）、未應用組（B1組，于造模第28天應用凡士林，涂抹28 d后取材）、應用組（B2組，于造模第28天應用復方肝素鈉尿囊素凝膠，與B1組同期取材）。C組又分為應用前對照組（C0組，于造模第42天取材）、未應用組（C1組，于造模第42天應用凡士林，涂抹28 d后取材）、應用組（C2組，于造模第42天應用復方肝素鈉尿囊素凝膠，與C1組同期取材）。共造模45只，每小組5只。未應用組和應用組每天固定時間在創面直徑3 cm范圍內均勻涂抹凡士林或復方肝素鈉尿囊素凝膠3次(各凝膠涂擦量為1.0 g)。

1.3.3 創面愈合率計算：觀察A組SD大鼠瘢痕組織的質地、顏色和上皮化程度，并用相機拍照。在3 d、7 d、14 d 、21 d、28 d、35 d 和42 d記錄創面情況，使用Adobe Photoshop CS6和 Image-Pro Plus 6.0軟件計算大鼠的愈合率。愈合率（%）=（S0-S）/S0×100%，其中S0為原始創面面積，S為未愈創面面積。創面完全愈合的標準為創面完全被上皮覆蓋，無殘余缺損，創面色均一光滑。

1.3.4 HE染色：收集各組瘢痕組織放入4%甲醛溶液中固定、脫水，OCT包埋后切成10μm厚的切片。蘇木精染色5 min，伊紅染色3 min，完成操作后將切片在Nikon顯微鏡下拍照，觀察組織形態。鏡下測量瘢痕組織以及鄰近的正常組織表皮層和真皮層厚度。取5個視野的平均值。

1.3.5 Masson染色：按照改良Masson三色染色試劑盒說明書進行染色，脫水后用二甲苯透明、封片，完成操作后將切片在Nikon倒置顯微鏡下拍照進行分析。觀察各組SD大鼠瘢痕組織膠原纖維的分布與排列。應用Image-Pro Plus 6.0進行分析，測量積分吸光度值和圖像面積，求每個視野積分吸光度與圖像面積的比值，記為光密度值。

1.3.6 實時熒光定量RT-PCR檢測：取SD大鼠瘢痕組織100 mg置于勻漿器中，加入裂解液進行勻漿，提取總RNA，并逆轉錄為cDNA，最后進行qPCR進行檢測。所需引物由上海生工生物有限公司合成。見表1。以GAPDH基因作為內參，采用lg2-ΔCT法計算瘢痕組織中IL-6和TNF-α mRNA的表達，ΔCT=CT（目的基因）-CT（GAPDH）。

表1 各基因引物序列

1.3.7 統計學分析：采用Excel進行數據匯總。GraphPad Prism version 5.0軟件進行制圖。SPSS 22.0統計軟件對數據進行統計學分析。采用Spapiro-Wilk進行正態性檢驗，Levene檢驗進行方差齊性檢驗。符合正態且方差齊的計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩獨立樣本進行t檢驗；多組數據采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD法。不符合正態分布計量資料采用M（P25,P75）表示，兩獨立樣本采用Mann-Whitney U檢驗；多組數據采用Kruskal-Wallis單因子方差分析，兩兩比較采用Dunnett法。P＜0.05為差異有統計學意義（雙尾）。

2 結果

2.1 復方肝素鈉尿囊素凝膠對創面愈合率的影響：燒傷后3 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d和42 d，對A1組和A2組創面進行拍照。見圖2。3 d、7 d和14 d，A1組和A2組創面愈合率比較差異無統計學意義（P＞0.05）。A1組在14 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠后，21 d創面愈合率與A2組比較差異有統計學意義（P＜0.05）；28 d、35 d和42 d創面愈合率與A2組比較差異無統計學意義（P＞0.05）。應用復方肝素鈉尿囊素凝對創面愈合率有一定影響。見圖3。

圖2 A1組和A2組不同時間大鼠燒傷創面愈合情況

圖3 A1組和A2組不同時間大鼠燒傷創面愈合率比較

2.2 不同時間應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對瘢痕組織厚度的影響：各組間大鼠創面臨近的正常皮膚組織表皮層和真皮層厚度比較差異無統計學意義（P＞0.05）。瘢痕組織厚度變化值為未應用組和應用組與應用前對照組的差值，即未應用和應用復方肝素鈉尿囊素凝膠28 d后瘢痕組織厚度的變化量。A2組和B2組瘢痕組織厚度的增長量較A1組和B1組低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。三個時間點未應用組和應用組瘢痕組織厚度的差值A組、B組均大于C組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖4。各組瘢痕組織HE染色結果見圖5。

表2 未應用組與應用組瘢痕厚度變化比較 （±s,μm）

表2 未應用組與應用組瘢痕厚度變化比較 （±s,μm）

images/BZ_16_217_654_1184_709.png

圖4 各組瘢痕組織厚度變化量比較

圖5 各組瘢痕組織HE染色結果（100×）

2.3 不同時間應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對瘢痕組織膠原纖維的影響：改良Masson染色瘢痕組織后，膠原纖維呈藍色，肌纖維、胞質、纖維素、角蛋白和紅細胞呈紅色，見圖6。膠原纖維光密度變化值為未應用和應用復方肝素鈉尿囊素凝膠28 d后瘢痕組織膠原纖維光密度值的變化量。A2組、B2組、C2組瘢痕組織膠原纖維光密度值的增長量分別較A1組、B1組、C1組低，差異有統計學意義（P＜0.05），見表3。三個時間點未應用組和應用組膠原纖維光密度值變化量差值比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。其中，A組明顯大于C組，差異有統計學意義（P＜0.05）；A組與B組、B組與C組比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖7。

圖6 各組瘢痕組織Masson染色結果（100×）

圖7 各組瘢痕組織膠原纖維光密度值變化量比較

表3 未應用組與應用組膠原纖維光密度值變化比較 [±s，M（P25,P75）]

表3 未應用組與應用組膠原纖維光密度值變化比較 [±s，M（P25,P75）]

images/BZ_16_210_2976_2243_3035.png

2.4 不同時間應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對瘢痕組織IL-6和TNF-α mRNA表達的影響：IL-6和TNF-α mRNA的相對表達變化值為未應用和應用復方肝素鈉尿囊素凝膠28 d后瘢痕組織IL-6和TNF-α mRNA相對表達的變化量。A2組IL-6和TNF-α mRNA相對表達的變化量較A1組低，差異有統計學意義（P＜0.05）；B2組IL-6 mRNA相對表達的變化量較B1組低，差異有統計學意義（P＜0.05）；B2組與B1組TNF-α mRNA相對表達的變化量比較差異無統計學意義（P＞0.05）；C2組與C1組IL-6和TNF-α mRNA相對表達的變化量比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表4。三個時間點未應用組和應用組IL-6 mRNA相對表達變化量的差值A組最大，B組次之，C組最小，差異有統計學意義（P＜0.05）；三個時間點未應用組和應用組TNF-αmRNA相對表達變化量的差值比較差異無統計學意義（P＞0.05），見圖8。

表4 未應用組與應用組IL-6和TNF-α mRNA相對表達量變化比較 （±s）

表4 未應用組與應用組IL-6和TNF-α mRNA相對表達量變化比較 （±s）

圖8 各組瘢痕組織IL-6和TNF-α mRNA相對表達變化量比較

2.5 各組炎性細胞、成纖維細胞和膠原纖維的分布與排列：A1組、B1組和C1組未應用復方肝素鈉尿囊素凝膠，炎性細胞明顯增多，成纖維細胞增生明顯，膠原纖維排列紊亂，結構致密，增生明顯。A2組、B2組和C2組應用復方肝素鈉尿囊素凝膠，炎性細胞相對較少，成纖維細胞和膠原纖維增生相對較少，膠原纖維排布相對規則，結構疏松，間隙較寬。見圖5～6。

3 討論

燒傷是日常生活中常見的意外傷害之一，我國每年有超2 000萬人因不同程度的燒傷入院，其中又以深Ⅱ度燒傷最為常見[7]。深Ⅱ度燒傷傷及真皮網層，因此極易發生異常增生，形成HS。復方肝素鈉尿囊素凝膠內含洋蔥提取液、肝素鈉和尿囊素，具有抑制成纖維細胞的增殖、避免組織硬化、抗炎、增加瘢痕表面彈力、減少病理性膠原過度增生和促進細胞上皮化的作用，常于創面愈合后立即應用，臨床治療作用明確，但有研究發現部分患者治療效果不甚理想[3-4]。瘢痕的增生過程可分為炎癥期（肉芽組織期）、增生期、重塑期（瘢痕成熟期）3個階段[5]。各個階段細胞生長環境不同，藥物作用效果也因應用時間不同可產生巨大的差異。在炎癥階段，炎癥細胞可浸潤到傷口位置，清除細菌和壞死組織，并分泌細胞因子激活成纖維細胞的增殖和血管發生；在增殖階段，創面完全愈合，成纖維細胞產生大量膠原纖維和及其他細胞質基質蛋白；在成熟階段，瘢痕組織重塑，最終成熟。有研究表明，深Ⅱ度燒傷大鼠創面成纖維細胞在第14天增殖最活躍[8]，在第28天創面基本愈合，開始進入增殖階段[9]。這也是本次實驗設定復方肝素鈉尿囊素凝膠應用時間的依據。

復方肝素鈉尿囊素凝膠作為一種抗HS的藥物，具有抗纖維母細胞增生和抑制細胞外基質生成的作用[10]。因此，在臨床中復方肝素鈉尿囊素凝膠在創面愈合后立即使用。本研究發現，燒傷后第3、7和14天，A1組和A2組創面愈合率比較差異無統計學意義。A1組在14 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠后，第21天創面愈合率與A2組比較差異有統計學意義,第28、35和42天創面愈合率與A2組比較差異無統計學意義。因此，應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對創面愈合有一定影響。

增生性瘢痕形成機制復雜，主要是由于皮膚過度修復，即真皮成纖維細胞為主的細胞大量增殖及以膠原纖維為主的細胞外基質過度堆積[11]。成纖維細胞和膠原纖維的排列結構和組成比例的改變可直接影響瘢痕組織的質地。在本研究中14 d和28 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠后成纖維細胞和膠原纖維的表達減少，最終有效抑制瘢痕增生，且14 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠后效果最明顯。大鼠創面在第14天成纖維細胞增殖最活躍[8]。推測復方肝素鈉尿囊素凝膠在成纖維細胞和膠原纖維活躍的初期作用更加明顯。而42 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠僅能抑制膠原纖維的表達，對瘢痕組織的厚度無明顯的影響，這可能是增生后期細胞處于相對穩定狀態，對藥物反應不明顯。

有研究表明，皮膚在損傷后為更好的進行修復，開始啟動機體免疫系統，適度的炎癥反應有利于溶解和去除組織碎片，抑制細菌，防止加重感染，而過度持續性的慢性炎癥則會造成創面愈合障礙并刺激成纖維細胞增殖分裂[12]。皮膚損傷后，在急性炎癥期積極治療，可抑制IL-1β、IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α等炎癥因子的過表達，進而抑制增生性瘢痕的產生和減少創面皮膚的色素沉積[13]。轉化生長因子β1（TGF-β1）及其下游Smad家族的信號轉導通路在增生性瘢痕發病機制中發揮關鍵作用。既往研究發現，IL-6 過表達可誘導Th1細胞反應，進而激活TGF-β1/Smad3信號通路，將急性炎癥轉變為慢性炎癥，促進纖維化狀態，從而導致瘢痕的增生[14-15]。本研究發現，14 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠可顯著降低IL-6和TNF-α mRNA的相對表達；28 d僅能顯著降低IL-6 mRNA的相對表達；42 d不能顯著降低IL-6和TNF-α mRNA的相對表達。提示在炎癥期應用復方肝素鈉尿囊素凝膠的抑炎作用更加明顯，后期由于創面愈合，炎癥因子表達相對降低，故復方肝素鈉尿囊素凝膠抑制炎癥作用降低。

本研究的目的是探討復方肝素鈉尿囊素凝膠抑制HS的最佳應用時間。在14 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠后，與未應用組比，僅在21 d瘢痕愈合產生差異，之后無明顯影響，這可能與復方肝素鈉尿囊素凝膠影響肉芽組織的產生同時具有抗炎作用，兩者作用效果疊加導致。王茶鋒等[16]研究發現，對122例兒童顏面部軟組織挫傷患者于術后早期應用復方肝素鈉尿囊素凝膠預防瘢痕，并隨訪6個月～1年，均無明顯瘢痕且外觀及功能的恢復理效果想。本研究也有相似的結果，在14 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對抑制瘢痕增生和膠原纖維生成方面明顯較28 d和42 d效果好。目前，復方肝素鈉尿囊素凝膠應用于完全愈合后，這是為防止其抑制創面愈合而引起感染。然而，隨著人們意識的提高、處理及時和抗生素的應用，燒傷創面感染的風險大大降低。提示，深Ⅱ度燒傷早期應用復方肝素鈉尿囊素凝膠對抑制瘢痕增生效果會更加明顯且不易發生感染。

綜上所述，深Ⅱ度燒傷后14 d、28 d和42 d應用復方肝素鈉尿囊素凝膠均可一定程度抑制大鼠瘢痕的增生，抑制膠原纖維和炎癥因子基因的表達，其中14 d應用效果最佳。為臨床更好的使用復方肝素鈉尿囊素凝膠治療HS提供了理論依據。