基于生物信息學(xué)篩選的胰腺癌差異基因及免疫浸潤機制預(yù)測靶向中藥

龍思丹，季雙雙，陳美池，贠張君，馬銀杰，薛 鵬，朱世杰*

1中國中醫(yī)科學(xué)院望京醫(yī)院腫瘤科，北京 100102；2北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，北京 100029

胰腺導(dǎo)管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)的全球負擔(dān)在過去25年中增加了一倍以上，預(yù)計2030年，PDAC將成為癌癥相關(guān)死亡的第2大原因[1]。PDAC患者五年的平均生存率僅8%，并且高達71%患者即使手術(shù)完全切除后也面臨復(fù)發(fā)的風(fēng)險[2]。這種高致死率和高復(fù)發(fā)率的腫瘤特性是由PDAC緊密的基質(zhì)成分(物理屏障)決定的[3]，其防止免疫效應(yīng)細胞浸潤到腫瘤中，使胰腺癌細胞能夠逃避免疫監(jiān)視。目前，許多臨床試驗嘗試通過免疫治療改善PDAC患者的整體療效，包括免疫檢查點抑制劑、癌癥疫苗、過繼細胞轉(zhuǎn)移等[4]，單抗治療的臨床效果不佳，仍未取得突破性進展。

隨著高通量遺傳分析的出現(xiàn)，基因表達譜分析成為了鑒定各種疾病差異表達基因的有效方法。CIBERSORT是一種分析工具，它使用微陣列數(shù)據(jù)或RNA測序數(shù)據(jù)來評估樣本中免疫細胞的表達，并獲得各種免疫細胞比率[5]。雖然目前已有多篇生物信息學(xué)針對PDAC差異基因進行了分析[6,7]，但缺乏進一步對于免疫機制和治療靶向預(yù)測的深入研究，尤其是在植物藥的治療潛力方面，中醫(yī)已對于PDAC常伴見的黃疸、腹水等病癥已形成系統(tǒng)認識，同時中藥以多靶點的天然優(yōu)勢能有效干預(yù)復(fù)雜的免疫微環(huán)境，值得深入挖掘。因此，本研究利用基因芯片數(shù)據(jù)庫(gene expression omnibus，GEO)，選擇PDAC患者配對組織樣本進行相關(guān)分析，從基因水平挖掘疾病機制，進行生存差異和免疫相關(guān)分析，通過CIBERSORT反卷積算法描繪PDAC組織中的免疫細胞浸潤模式，最后綜合預(yù)測和篩選潛在的有效中藥，為臨床藥物的選擇、研發(fā)提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 差異基因篩選

以“Pancreatic Cancer”為關(guān)鍵詞檢索GEO基因表達綜合數(shù)據(jù)庫，篩選條件：(1)“Expression profiling by array”(2)“Homo sapien”(3)PDAC和癌旁組織。(4)組織來自同一患者的成對匹配樣本。(5)全基因表達譜。(6)數(shù)據(jù)詳細，包括Gene Symbol等信息。最終篩選得到GSE15471基因芯片為本次研究分析的對象。GSE15471數(shù)據(jù)集的處理過程：在Affymetrix U133 plus 2.0全基因組微陣列上分析，并且進行了重復(fù)的微陣列雜交，以測量技術(shù)測量誤差，因此總共進行了78次基因芯片雜交。其中一個樣本不符合質(zhì)量控制被排除，隨后使用RMA算法對微陣列數(shù)據(jù)進行標準化。應(yīng)用GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)在線工具及Excel軟件篩選芯片胰腺癌組織與正常組織的差異表達基因，篩選條件|log2FC| ≥ 1和校正P< 0.05進行差異基因分析。

1.2 蛋白網(wǎng)絡(luò)互作及功能注釋

核心差異基因通過STRING數(shù)據(jù)庫獲取蛋白網(wǎng)絡(luò)互作(protein-protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)模型，并將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件中，采用Cytoscape插件工具cyto Hubba中的MCC方法識別重要基因，將重要基因進行可視化運用R語言程序中的“cluster Profiler”插件包進行差異基因的基因本體論(gene ontology，GO)與京都基因和基因組百科全書(kyoto encyclopedia of genesand genomes，KEGG)分析，包括生物過程(biological process，BP)、細胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)。

1.3 核心基因表達水平差異

利用GEPIA數(shù)據(jù)庫(http://gepia.cancer-pku.cn/)明確核心差異基因在胰腺癌中的表達水平，匹配的正常數(shù)據(jù)來自TCGA和GTEx數(shù)據(jù)。免疫組化(immunohistochemistry，IHC)通過利用抗體 - 抗原結(jié)合的高特異性，可以揭示蛋白質(zhì)的相對分布和豐度。免疫組化數(shù)據(jù)來自人類蛋白質(zhì)圖譜(https://www.proteinatlas.org/)，比較了正常和癌癥組織中目標基因在蛋白水平的表達差異。

1.4 核心差異基因與胰腺癌患者生存時間、組織免疫浸潤的相關(guān)性

Kaplan-Meier Plotter數(shù)據(jù)庫(http://kmplot.com/analysis/)中Kaplan-Meier曲線對排名前五位的核心差異基因進行總生存率(overall survival，OS)和無復(fù)發(fā)生存率(relapse-free survival，RFS)分析；利用TIMER數(shù)據(jù)庫(https://cistrome.shinyapps.io/timer/)，調(diào)整PC的腫瘤純度后，探索前五位核心差異基因與B細胞、CD4+T細胞、CD8+T細胞、樹突狀細胞、巨噬細胞等免疫細胞浸潤程度的相關(guān)性。

1.5 獲取免疫浸潤矩陣、免疫細胞間相關(guān)性及組間差異分析

采用R語言程序并鏈接CIBERSORT反卷積算法進行22種免疫細胞轉(zhuǎn)錄特征的模擬計算。設(shè)定模擬次數(shù)為1000次，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗對P< 0.05的數(shù)據(jù)進行后續(xù)分析。

對CIBERSORT反卷積算法以P< 0.05基礎(chǔ)上篩選的可信樣本數(shù)據(jù)中進行不同免疫細胞間Pearson相關(guān)系數(shù)計算，并采用秩和檢驗比較胰腺癌組與對照組差異。

1.6 免疫細胞特征分析

對納入樣本中PC患者不同胰腺組織區(qū)域來源的腫瘤組織及正常組織樣本進行免疫細胞差異分析，獲得癌組織的免疫細胞浸潤情況及特征。

1.7 潛在有效中藥的預(yù)測

Coremine Medical(https://coremine.com/medical/)數(shù)據(jù)庫是一個開放的生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)分析平臺，記錄了大量生物醫(yī)學(xué)術(shù)語間的關(guān)系。將兩組差異的核心靶基因和GO富集與免疫相關(guān)BP導(dǎo)入Coremine Medical數(shù)據(jù)庫，分別篩選具有潛在效應(yīng)機制的中藥。設(shè)置篩選條件P< 0.01，篩選可用于胰腺癌治療的中藥。

2 結(jié)果

2.1 胰腺癌差異基因

選取GEO數(shù)據(jù)庫中的GSE15471基因芯片進行分析，該芯片來自36位PC患者，病理類型為最常見的PDAC，以其腫瘤組織和自身匹配的正常胰腺組織為樣本，并且為減少技術(shù)誤差共進行了78次基因芯片雜交。篩選獲得差異基因2 653個，其中上調(diào)基因2 305個，下調(diào)基因348個，前20個上下調(diào)基因的表達分布情況(見圖1A)，差異基因整體表達情況(見圖1B)。

圖1 PDAC基因差異表達熱圖及火山圖分析Fig.1 Heat map and volcano map of differential gene expression in PDAC注：A：Group A為正常組織；Group B為腫瘤組織；B：差異基因分布，藍色、灰色、紅色分別表示下調(diào)、無差異、上調(diào)。Note:A,Group A is normal tissue;Group B is tumor tissue;B:Blue,grey and red indicate down-regulation,no difference,and up-regulation,respectively.

2.2 核心基因、PPI及功能注釋

將2 653個差異表達基因?qū)隨TRING，選擇最高置信值0.9,去除無連接的基因后得到PPI。將分析結(jié)果文件導(dǎo)入Cytoscape軟件進行可視化顯示共有94個節(jié)點，160條邊(見圖2)。經(jīng)cyto Hubba計算列取前10位作為核心基因，表達均呈現(xiàn)上調(diào)(見圖3)，按重要程度依次排序為I型膠原蛋白a-2(collagen type I alpha 2 chain，COL1A2)、I型膠原蛋白a-1(collagen type I alpha 1 chain，COL1A1)、III型膠原蛋白a-1(collagen tpe III alpha 1 chain，COL3A1)、V型膠原蛋白a-1(collagen type V alpha 2 chain，COL5A1)、V型膠原蛋白a-2(collagen type V alpha 2 chain，COL5A2)、具有血小板反應(yīng)蛋白基序的去整合素和金屬蛋白酶2(ADAM metallopeptidase with thrombospondin type 1 motif 2，ADAMTS2)、基膜聚糖(lumican，LUM)、整合素Α2(integrin alpha 2，ITGA2)、纖維粘黏蛋白1(matrix metallopeptidase 2，MMP2)。

圖2 差異基因PPI Fig.2 Differential gene PPI注：顏色越深代表該節(jié)點的度值越大，重要程度越高。Note:The darker the color means the greater the degree value of the node,the higher the importance.

圖3 核心蛋白基因模塊Fig.3 Core protein gene module注：顏色越深代表該節(jié)點的度值越大，重要程度越高。Note:The darker the color means the greater the degree value of the node,the higher the importance.

2.3 核心基因表達水平差異

為了驗證以上篩選出來的核心基因是否具有代表性和是否具有作為治療目標的潛力，我們分析了核心基因在癌癥和癌癥鄰近組織中的差異性表達。GEPIA數(shù)據(jù)庫的分析結(jié)果顯示，前五位核心基因COL1A2、COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2在PDAC組織中的表達水平均明顯高于正常胰腺組織(見圖4A～4E)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。HPA數(shù)據(jù)庫的IHC結(jié)果顯示，在蛋白表達水平，COL1A2、COL1A1、COL3A1、COL5A1在胰腺癌中的表達高于正常胰腺組織(見圖4F～4I)，COL5A2缺乏相關(guān)數(shù)據(jù)。該部分結(jié)果一定程度上驗證了以上生信分析的結(jié)果。

圖4 關(guān)鍵基因在胰腺癌組織和正常胰腺組織中的差異性表達Fig.4 Differential expression of key genes in PDAC tissues and normal pancreatic tissues

2.4 核心差異基因介導(dǎo)的生存分析、免疫浸潤

將前5個核心差異基因進行胰腺癌生存分析，結(jié)果顯示(見圖5)COL1A2、COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2基因上調(diào)表達的患者均表現(xiàn)出較差的OS(排列在前)和RFS(排列在后)，并且以上基因?qū)τ诨颊逺FS均具有顯著的影響(P< 0.05)，但是對于患者OS并沒有統(tǒng)計學(xué)意義，說明針對PDAC患者OS的影響，核心差異基因表達水平的改變并非獨立的影響因素。

圖5 核心差異基因與生存分析Fig.5 Core differential genes and survival analysis

進一步探討核心差異基因是否通過介導(dǎo)免疫浸潤模型改變腫瘤微環(huán)境，從而影響最終生存率，結(jié)果顯示(見圖6)，該5個核心差異基因與腫瘤純度均呈現(xiàn)負相關(guān)(P< 0.05)，然而除了COL5A1和COL5A2與CD4+T細胞無顯著相關(guān)，其余基因與常見六種免疫浸潤細胞均呈顯著正相關(guān)。

圖6 核心差異基因與免疫細胞浸潤的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation analysis of core difference genes and immune cell infiltration

2.5 GO及KEGG富集分析結(jié)果

為了更加全面了解疾病發(fā)病機制中差異基因的功能及其相關(guān)免疫過程，利用R語言程序?qū)Σ町惢蜻M行生物學(xué)功能及通路富集分析。差異基因的GO分析(見圖7A)。其中，獲取BP 2 950條，與免疫相關(guān)的生物學(xué)過程主要涉及中性粒細胞激活與脫顆粒、血小板脫顆粒、趨化因子介導(dǎo)的信號通路、T輔助細胞的分化、免疫系統(tǒng)過程的負向調(diào)節(jié)、體液免疫反應(yīng)等，詳見表1。KEGG富集的相關(guān)通路主要涉及蛋白質(zhì)消化與吸收、細胞外基質(zhì)受體相互作用、PI3K/Akt信號傳導(dǎo)、衰老等相關(guān)信號通路(見圖7B)。

表1 胰腺癌差異基因免疫浸潤相關(guān)GO富集分析列表Table 1 List of GO enrichment analysis associated with immune infiltration of differential genes in pancreatic cancer

圖7 GO及KEGG富集分析Fig.7 GO and KEGG enrichment analysis注：圓形越大占比越高，顏色越深則差異越大。Note:The larger the circle the higher the percentage,and the darker the color the greater the difference.

2.6 免疫浸潤細胞分布特征及關(guān)聯(lián)性分析

采用CIBERSORT反卷積法以P< 0.05為篩選條件對芯片進行篩選，共得到77個可信樣本，熱圖左側(cè)35個為正常胰腺組織，右側(cè)42個為PDAC組織。結(jié)果顯示(見圖8)，與正常胰腺組織相比，胰腺癌組織中CD8+T細胞浸潤程度低、而CD4+記憶T細胞、M2巨噬細胞、樹突狀細胞等浸潤程度較高。進一步分析了22種免疫細胞在樣本中的分布變化特征(見圖9)。

圖8 正常胰腺組織與胰腺癌組織的免疫細胞分布熱圖Fig.8 Heat map of immune cell distribution between normal pancreatic tissue and pancreatic cancer tissue

圖9 22種免疫細胞浸潤比例柱狀圖Fig.9 Histogram of the proportion of 22 types of immune cell infiltration

NK細胞與CD8+T細胞(r= 0.73)、活化樹突狀細胞與CD8+T細胞(r= 0.75)、調(diào)節(jié)T細胞與活化樹突狀細胞(r= 0.71)、肥大細胞與CD8+T細胞(r=0.64)等呈現(xiàn)較強正相關(guān)；M1巨噬細胞和記憶T細胞分別與活化樹突狀細胞(r= -0.59；r= -0.64)、活化肥大細胞與未活化肥大細胞(r=-0.62)之間呈現(xiàn)較強負相關(guān)(見圖10)。

圖10 22種免疫細胞相關(guān)性熱圖Fig.10 Heat map of 22 immune cell correlations

2.7 免疫細胞浸潤差異性分析

通過小提琴圖(見圖11)對不同組織樣本免疫浸潤細胞差異分析進行可視化，發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中活化的記憶CD4+T細胞、未活化NK細胞、M0/M1/M2巨噬細胞、未活化樹突狀細胞、中性粒細胞的浸潤程度顯著增多(P< 0.05)；同時，初始B淋巴細胞、血小板、CD8+T細胞、未活化記憶CD4+T細胞、輔助T細胞、調(diào)節(jié)T細胞、活化NK細胞、單核細胞、活化樹突狀細胞的浸潤程度顯著減少(P< 0.05)。

圖11 正常組織與腫瘤組織之間的免疫浸潤差異Fig.11 Differences in immune infiltration between normal and tumor tissues注：藍色代表正常胰腺組織，紅色代表胰腺癌組織。Note:Blue represents normal pancreatic tissue,red represents pancreatic cancer tissue.

進一步篩選獲得38組符合要求的配對樣本，樣本中各種免疫細胞改變趨勢進行分析的結(jié)果表明(見圖12)，在PDAC發(fā)病過程中個體免疫細胞變化趨勢不盡完全一致，但可以觀察到M0巨噬細胞多呈上升趨勢(P= 0.001)、活化的NK和DC細胞多呈下降趨勢(P= 0)。

圖12 胰腺癌配對樣本免疫浸潤特征組合Fig.12 Immune infiltration characteristics of paired samples of pancreatic cancer

2.8 中藥預(yù)測分析

通過Coremine Medical預(yù)測具有潛在治療PDAC的中藥，輸入前十名核心差異基因及篩選得到的免疫相關(guān)生物過程名稱。若以P< 0.05為篩選標準獲得不同靶點的中藥227味，刪除重復(fù)的53味中藥后獲得174味中藥。為更加精準選擇用藥，最終確定以P< 0.01為篩選標準，規(guī)范中藥名稱后，進行整理共獲得77種中藥，其中某些基因及生物學(xué)過程缺乏符合要求的中藥，最終結(jié)果詳見表2。將最終得到的中藥輸入Cytoscape，出現(xiàn)2次以上為高頻中藥，葶藶子、姜黃、皂莢、白附子、桂枝、杜仲、人參、雷丸、香椿、鹿角、三七的度值較高(見圖13)。整體預(yù)測中藥的功效分布以清熱類(22味)、補益類(10味)、祛風(fēng)濕(9味)為主，多歸肝經(jīng)(見圖14A、14B)。

表2 中藥靶向核心差異基因及免疫相關(guān)生物學(xué)過程的預(yù)測結(jié)果Table 2 Predicted results of Chinese medicine targeting core differential genes and immune-related biological processes

圖13 靶向關(guān)鍵基因和免疫相關(guān)通路的中藥預(yù)測Fig.13 Traditional Chinese medicines predicted by key genes and immune-related pathways注：圖13中黃色菱形、三角形、圓形節(jié)點分別表示免疫相關(guān)生物學(xué)過程、核心基因、預(yù)測中藥；顏色越深代表關(guān)聯(lián)性越強；Note:The yellow prism,triangle and circle nodes in Figure 13 indicate immune-related biological processes,core genes,and predicted herbal medicines,respectively;the darker the color represents the stronger the association.

圖14 中藥預(yù)測特征可視化Fig.14 Visualization of Chinese medicine prediction features注：A為中藥歸經(jīng)雷達圖；B為中藥功效分布圖。Note：A is the radar map of herbal medicine attribution;B is the distribution of herbal medicine efficacy.

3 討論與結(jié)論

目前，胰腺癌的免疫治療取得了一定進展，給臨床治療胰腺癌帶來了希望，然而，由于胰腺癌的微環(huán)境通常包括免疫抑制細胞增多、免疫細胞失活和腫瘤突變負荷低等狀態(tài)，多數(shù)免疫治療結(jié)果并不令人滿意。隨著高通量技術(shù)的發(fā)展，Lv等[8]通過多個數(shù)據(jù)集來挖掘胰腺癌的差異核心基因，Xiao等[9]通過“炎-癌”差異基因挖掘中藥等等，都加深了對胰腺癌發(fā)病分子機制的理解，但是對于該病免疫相關(guān)機制的工作開展不足，不利于改善患者的長期生存預(yù)后。因此，本研究首次在差異基因的基礎(chǔ)上，進一步挖掘相關(guān)免疫浸潤機制和潛在有效中藥，旨在完善機制和促進藥物開發(fā)。首先，本研究通過GEO數(shù)據(jù)庫篩選合適的基因芯片，比較同一個體患者的胰腺腫瘤與正常組織樣本的基因表達譜，得到2 653個差異基因，并通過PPI得到核心差異基因，分別是細胞外基質(zhì)組織和膠原纖維組織相關(guān)基因(COL1A2、COL1A1、COL3A1、COL5A1、COL5A2)、ADAM金屬肽酶(ADAMTS2)、基膜聚糖(LUM)、整合素亞基α2(ITGA2)、纖維連接蛋白(FN1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP2)。以上差異基因經(jīng)證明在腫瘤組織中均表達上調(diào)，與膠原蛋白代謝相關(guān)，多屬于COL1、COL3和COL5家族[10]，其中COL1A2的表達通過qRT-PCR測定驗證在組織中表達最高[11]，反應(yīng)此次結(jié)果可信度高。與其他實體瘤不同，PDAC腫瘤微環(huán)境是一個包含胰腺星狀細胞、癌相關(guān)成纖維細胞、免疫細胞和細胞外基質(zhì)過度纖維化的致密基質(zhì)環(huán)境，基質(zhì)中密集纖維化反應(yīng)和腫瘤在免疫環(huán)境中的改變被認為是目前PDAC治療失敗的主要原因。進一步通過生存分析研究揭示該類核心差異基因與PDAC患者RFS顯著相關(guān)，并且與多種腫瘤細胞浸潤程度呈正相關(guān)，提示該類基因可能通過改變腫瘤免疫微環(huán)境介導(dǎo)PDAC患者的臨床預(yù)后，如何借助該點改變臨床結(jié)局成為可能的突破口之一。

進一步對差異基因進行GO及KEGG富集分析，提示差異基因的生物學(xué)過程涉及中性粒細胞脫顆粒、遷移、趨化因子、T輔助細胞分化、體液免疫反應(yīng)等過程。PDAC微環(huán)境本質(zhì)上是炎癥的，趨化因子等促進腫瘤炎性微環(huán)境的事實也已經(jīng)被證明，除細胞因子和趨化因子外，中性粒細胞的激活往往是第一個分子事件，隨后發(fā)生遷移向腫瘤組織趨化。已經(jīng)明確的是PDAC癌細胞可以將多形核中性粒細胞募集到腫瘤附近，但大多無法產(chǎn)生抗腫瘤反應(yīng)，通常高豐度的中性粒細胞數(shù)量會促進PDAC的進展，與預(yù)后不良有關(guān)[12]；最近體外實驗表明，胰腺癌細胞誘導(dǎo)中性粒細胞胞外陷阱形成，從而促進PDAC肝臟微轉(zhuǎn)移的發(fā)生[13]；同時高度纖維化導(dǎo)致的局部缺氧變化決定了免疫環(huán)境，活性氧的持續(xù)釋放導(dǎo)致局部缺氧，從而增強中性粒細胞浸潤，因此，中性粒細胞在胰腺癌微環(huán)境中至關(guān)重要[14]。并且，本次研究結(jié)果提示差異基因直接參與了T細胞的分化和體液免疫的調(diào)節(jié)。

為深入探索免疫浸潤在PDAC發(fā)病中的作用，本研究利用CIBERSORT反卷積法對總體腫瘤樣本進行分析，與正常胰腺組織相比，腫瘤組織中M2巨噬細胞、靜息記憶CD4+T細胞顯著增高，而CD8+T細胞顯著下降，在配對樣本中觀察到了同樣趨勢。M2巨噬細胞產(chǎn)生促進腫瘤進展的抗炎信號，經(jīng)確認是胰腺癌預(yù)后不良的標志之一。2013年，一項通過IHC觀察PDAC患者免疫細胞浸潤程度的研究表明，較高水平的腫瘤浸潤性泛巨噬細胞M2、Tregs與CD4+T與較短的生存期顯著相關(guān)[15]。在PDAC小鼠模型中已經(jīng)證明腫瘤相關(guān)巨噬細胞通過釋放細胞因子、蛋白酶和生長因子介導(dǎo)免疫抑制和血管生成并促進腫瘤進展[16]，并且，抑制CCR2已被證明可通過阻斷單核細胞募集到腫瘤微環(huán)境中來提高化療效果、抑制轉(zhuǎn)移、增強放療效果并增加T細胞免疫浸潤[17,18]。因此，巨噬細胞極可能成為人類PDAC新治療策略的潛在目標。既往認為由成纖維細胞和促纖維母細胞組成的PDAC免疫抑制微環(huán)境會限制T細胞浸潤，但最近的研究揭示了T細胞的特定空間分布，正如相關(guān)性熱圖顯示胰腺癌組織中靜息的記憶CD4+T細胞與CD8+T細胞之間存在顯著負相關(guān)(r = -0.64)，這已被證明是預(yù)后不佳的標志之一，尤其是PDAC，CD8+T細胞在腫瘤組織中的浸潤與腫瘤細胞緊密接近和患者存活率緊密相關(guān)[19]。最近有學(xué)者強調(diào)在長期幸存者中建立成功的免疫更需要高豐度的腫瘤內(nèi)CD8+T細胞，了解CD8+T細胞的驅(qū)動因素以及CD8+T細胞的浸潤機制，對于進一步開發(fā)PDAC治療方案至關(guān)重要[14]。目前，PDAC免疫浸潤細胞之間的關(guān)聯(lián)尚缺乏大規(guī)模的驗證，本預(yù)測具有一定參考意義。

PDAC在中醫(yī)屬于“脾積”“癥瘕”“積聚”“痞氣”“伏梁”等范疇。病例系列文獻研究和Meta分析結(jié)果提示聯(lián)合中醫(yī)藥治療PDAC能夠有效降低患者死亡率，改善遠期預(yù)后[20]。最近基礎(chǔ)研究揭示中草藥治療PDAC的機制多通過改善腫瘤微環(huán)境而間接改善醫(yī)療結(jié)局[21]，故探索腫瘤免疫微環(huán)境對尋找有效中藥十分重要。目前，PDAC中醫(yī)病機多認為是“本虛標實”，以濕熱蘊毒為著，而本研究預(yù)測中藥的功效多屬于清熱類(黃芩、山慈姑、牡丹皮、紫草等)，其次為補益藥(人參、杜仲、仙茅、龜甲、阿膠等)，符合中醫(yī)病機。從病位而言，對比中醫(yī)古籍中關(guān)于解剖位置和生理功能的描述，多數(shù)學(xué)者支持將胰歸屬于五臟中的脾，但本次研究顯示絕大多數(shù)有效預(yù)測中藥歸屬肝經(jīng)，其次是肺、腎經(jīng)，提示我們或許從肝論治濕熱，結(jié)合扶助脾虛能夠進一步提高治療有效率，經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)該理論已有散在經(jīng)驗[22]和綜述報道[23]，值得深入探討形成系統(tǒng)認識。此外，本研究利用反向預(yù)測的方法獲得了數(shù)味中藥，在關(guān)聯(lián)度較高的中藥隊列中，研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷能夠通過下調(diào)MMP2等表達從而減少血管生成，降低腫瘤細胞營養(yǎng)供給[24]；姜黃素通過Wnt/β-Catenin信號通路活性抑制PDAC干細胞的自我更新[25]，并可改善PDAC皮下移植瘤模型組織的局部微循環(huán),增加腫瘤微環(huán)境中的供血供氧,抑制腫瘤細胞和間質(zhì)細胞的低氧應(yīng)激反應(yīng)[26]；以上文獻支持了本研究的部分預(yù)測結(jié)果，但有關(guān)中藥治療PDAC相關(guān)免疫機制的研究開展仍十分不足。

本研究在篩選基因芯片時考慮到免疫機制分析的個體差異，嚴謹篩選了采用配對樣本分析的PDAC實驗數(shù)據(jù)，同時考慮到本研究本質(zhì)上是對既往單個GSE數(shù)據(jù)的二次挖掘，采用了不同水平來驗證核心差異基因的表達，降低了風(fēng)險。但是本研究仍存在以下不足：(1)由于樣本量過少導(dǎo)致數(shù)據(jù)分析具有一定偏倚，后期納入更多符合要求的數(shù)據(jù)集來進行分析；(2)CIBERSORT反卷積算法分析是基于有限的遺傳數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)可能會偏離細胞異型相互作用、疾病的誘發(fā)因素以及疾病表型的可塑性，臨床和基礎(chǔ)試驗可以更加全面、客觀地反映個體免疫情況。總之，本研究首次利用生物信息學(xué)技術(shù)結(jié)合CIBERSORT反卷積算法探索了PDAC的免疫浸潤機制，并預(yù)測潛在可能有效的中藥，對未來該領(lǐng)域的研究具有一定價值。