基于高效液相指紋圖譜及網絡藥理學預測分析山銀花質量標志物

周新茹，王志輝,2，龍雨青，曾 梅，楊 敏，童巧珍,2 ,3，周日寶,2,3*，劉湘丹,2,3*

1湖南中醫藥大學藥學院；2 湘產大宗道地藥材種質資源及規范化種植重點研究室；3湖南省普通高等學校中藥現代化研究重點實驗室，長沙 410208

山銀花甘，寒，歸肺、心、胃經，具清熱解毒，疏散風熱功效，用于癰腫疔瘡、喉痹、丹毒、熱毒血痢、風熱感冒、溫病發熱等癥[1]，目前《中國藥典》有山銀花的中成藥處方達80多個，如感冒止咳片、口炎清片、感冒止咳膠囊、清肝利膽顆粒、銀屑靈顆粒等。山銀花不僅為大宗常用中藥材、成方制劑原材料，也是化工香料提取原料，同時還作為茶葉和護膚保健品開發，市場應用前景廣闊。

現代研究表明，山銀花化學成分數量多且復雜，包括有機酸類、三萜皂苷類、黃酮類、揮發油類及微量元素等[2]。目前《中國藥典》僅將綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙及川續斷皂苷乙作為山銀花質量評價指標，只對有機酸類與皂苷類共3種化學成分做了限量規定。大量研究表明木犀草苷等黃酮類成分也是山銀花發揮藥效的物質基礎，中藥化學成分復雜，發揮藥效并不僅依靠某一化學成分，而是多個組分內部之間存在普遍的加合作用，因此僅以少數成分對藥材進行品質評價不夠全面。

為提升規范中藥材及產品質量標準，劉昌孝院士[3-7]在研究分析現有質量評價控制方法問題的基礎上，于2016年提出了中藥質量標志物(Q-Marker)的概念。中藥質量標志物有傳遞與溯源、特有性、有效性、可測性及復方配伍五原則[8-10]，可作為較全面的中藥材及產品質量評價控制指標。Q-Marker這一概念提出后，被廣泛應用于解析中藥材、飲片、制劑與有效性密切相關的中藥內在化學質量屬性，為中藥材及其產品的全過程質量控制及質量溯源提供了新的思路。

隆回、溆浦為湖南灰氈毛忍冬來源山銀花主產區，根據其花冠后期是否展開分五彩花(花冠展開)和湘蕾(花冠不展開)兩大類，目前產地初加工方式主要有蒸汽殺青與低溫干燥兩種，從而市場形成了四種湘產山銀花藥材規格：蒸汽殺青湘蕾、低溫干燥湘蕾、蒸汽殺青五彩花、低溫干燥五彩花。為評價不同規格湘產山銀花質量，建立比較全面的質量評價指標，本文基于中藥質量標志物的概念，結合HPLC指紋圖譜、多元統計分析和網絡藥理學等研究方法預測并驗證山銀花Q-Marker，以期為山銀花質量評價和質量控制提供思路和參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀(包括G1312C二元泵、G1316A柱溫箱、G7129A自動進樣器、VVID檢測器，美國Agilent公司)；色譜柱：Agilent ZORABAX SB-C18(250 mm×4.6 mm)；SK8200型超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)；Eco-S15型實驗室純水系統(上海和泰儀器有限公司)。

1.2 試藥

新綠原酸(20 mg/支，批號：19081403)；綠原酸(20 mg/支，批號：18071907)；咖啡酸(20 mg/支，批號：20110501)；獐芽菜苷(20 mg/支，批號：19090902)；3，4-二-O-咖啡酰奎寧酸(異綠原酸B，20 mg/支，批號：21022308)；3，5-二-O-咖啡酰奎寧酸(異綠原酸A，20 mg/支，批號：21032304)；灰氈毛忍冬皂苷乙(20 mg/支，批號：20072203)；川續斷皂苷(20 mg/支，批號：19120601)對照品均購自成都普菲德生物科技有限公司，質量分數均≥98%；甲醇、乙腈、磷酸均為色譜純；水為超純水；其余試劑均為分析純。29批山銀花樣品采自湖南隆回和溆浦，具體信息見表1，經湖南中醫藥大學周日寶教授與劉湘丹副教授鑒定為忍冬科植物灰氈毛忍冬L.macranthoidesHand.-Mazz.的干燥花蕾及帶初開的花。

表1 山銀花樣品來源信息表Table 1 Information of the source of Lonicerae Flos samples

續表1(Continued Tab.1)

1.3 數據庫與軟件

中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012 年版)；Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)；STRING(https：//string-db.org/)數據庫；Cytoscape 3.8.2軟件；Metascape(www.metascape.org/)數據庫；PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)；ZINC數據庫(http://zinc.docking.org)；Schr?dinger軟件。

2 方法與結果

2.1 山銀花指紋圖譜研究

2.1.1 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠(非親水性)為填充劑(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈為流動相A，以0.4%磷酸水溶液為流動相B，按下表2進行梯度洗脫；柱溫30 ℃；檢測波長：210 nm。

表2 梯度洗脫條件Table 2 Gradient elution conditions

2.1.2 對照品溶液制備

精密稱取新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷甲、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙對照品適量，用70%甲醇溶解分別制得對照品溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。

2.1.3 供試品溶液制備

精密稱取供試山銀花樣品粉末1 g，置于帶塞錐形瓶中，加入70%甲醇溶液50 mL，稱重，靜置12 h后，室溫超聲30 min后用70%甲醇補重，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，制得供試品溶液。

2.1.4 方法學考察

2.1.4.1 精密度試驗

取S20號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖。以異綠原酸A為參照峰，測得22個共有峰相對保留時間的RSD在0.003%～2.07%，相對峰面積的RSD在1.00%～2.99%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 重復性試驗

取S20號樣品6份，每份精密稱取1 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，記錄色譜圖。以異綠原酸A為參照峰，測得22個共有峰相對保留時間的RSD在0.01%～2.78%，相對峰面積的RSD在0.52%～2.67%，表明該方法重復性良好。

2.1.4.3 穩定性試驗

精密稱取S20號樣品1 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下，分別于0、4、8、12、18、24 h進樣，進行色譜分析，記錄色譜圖。以異綠原酸A為參照峰，測得22個共有峰相對保留時間的RSD在0.30%～2.57%，相對峰面積的RSD在0.31%～3.00%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.1.5 指紋圖譜的建立

將29批山銀花藥材樣品供試品溶液分別進樣測定，將圖譜以AIA格式保存，導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012 年版)。以S1號圖譜作為參照譜，采用中位數法，進行多點校正和色譜峰匹配，29批山銀花藥材樣品共得到了22個共有峰，其指紋圖譜疊加圖見圖1，對照指紋圖譜見圖2，混合對照品圖譜見圖3。

圖1 29批山銀花樣品指紋圖譜疊加圖Fig.1 Fingerprint superposition of 29 batches of Lonicerae Flos

圖2 29批山銀花對照指紋圖譜Fig.2 Reference fingerprint of Lonicerae Flos

圖3 混合對照品圖譜Fig.3 HPLC of mixed reference substances注：1-新綠原酸；2-綠原酸；3-咖啡酸；4-獐牙菜苷；5-木犀草苷；6-異綠原酸B；7-異綠原酸A；8-灰氈毛忍冬皂苷乙；9-灰氈毛忍冬皂苷甲；10-川續斷皂苷乙。Note:1-Neochlorogenic acid;2-Chlorogenic acid;3-Caffeic acid;4-Sweroside;5-Cynaroside;6-Isochlorogenic acid B;>7-Isochlorogenic acid A;8-Macranthoidin B;9-Macranthoidin A;10-Dipsacoside B.

2.1.6 相似度分析

將 29批山銀花的圖譜導入中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統軟件(2012 年版)，計算相似度，結果29批山銀花的相似度見表3。29批山銀花的指紋圖譜相似度均>0.95，表明所采集的山銀花樣品質量穩定均一。

表3 山銀花藥材相似度結果Table 3 Results of similarity evaluation of 29 batches of Lonicerae Flos

2.1.7 層次聚類分析

運用SPSS 26數據統計軟件，采用組間聚類方法，歐氏距離平方法測量樣品間距離進行系統聚類分析(hierarchical clustering analysis，HCA)，結果見圖4。由圖可知，在分類距離為20時，山銀花樣本被分為兩大類，S1、S4、S5、S15、S16、S22、S23、S26、S27、S29 、S6、S7、S17、S18為一類，S3、S8、S13、S14、S19、S24、S28、S2、S9、S10、S11、S12、S20、S21、S25為一類。在距離為6時，樣本被分為4類，山銀花各批次間有明顯的分類距離；S1、S4、S5、S15、S16、S22、S23、S26、S27、S29被歸為一類，S6、S7、S17、S18被分為一類，S3、S8、S13、S14、S19、S24、S28 被分為一類，S2、S9、S10、S11、S12、S20、S21、S25被歸為一類。

圖4 聚類分析結果Fig.4 Systematic tree map

2.1.8 正交偏最小二乘法判別分析

圖5 山銀花成分VIP圖Fig.5 OPLS-DA score scatter plot of 29 batches of Lonicerae Flos

2.2 基于成分-靶點-通路的有效性分析

對本研究圖5中VIP>1且通過對照品指認的八種化學成分(綠原酸、異綠原酸A、新綠原酸、獐芽菜苷、異綠原酸B、灰氈毛忍冬皂苷乙、咖啡酸、川續斷皂苷乙)進行網絡藥理學研究，驗證分析山銀花的潛在質量標志物的有效性，相關活性化合物信息如表4所示。

表4 活性化合物信息表Table 4 Information of active compound

2.2.1 靶標的預測篩選與蛋白質互作網絡構建及分析

使用 Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數據庫對以上8個活性化合物進行靶標預測，選擇其中可能性(Probability)大于0的靶點合并、刪除重復項，共獲得154個人源靶標。將潛在靶標導入STRING(https：//string-db.org/)數據庫，選擇物種為人類，設置combined_score≥0.9的97個靶標作為相互作用關系數據 ，通過Cytoscape 3.8.2軟件繪制PPI網絡，并使用Cytoscape 3.8.2軟件中的Network Analyze工具進行網絡拓撲學分析，計算度值(degree)、介數中心性(betweenness centrality)和接近中心性(closeness centrality)等參數，見圖6。該網絡由97個節點(靶標)組成，以尺寸和顏色來表示拓撲學參數值大小，顏色越深尺寸越大表示拓撲學參數越大。選取度值≥6(二倍中位數)、介數中心性和接近中心性2 個重要拓撲參數均大于中位數的靶點作為核心靶點[11]，如圖6所示，核心靶標共有16個：STAT3、EGFR、MAPK1、APP、PIK3CA、ITGB1、CASP3、FYN、ESR1、LCK、CASP8、PRKCD、MAP2K1、ERBB2、SYK、JUN。

圖6 蛋白質互作圖Fig.6 Protein-protein interaction network

2.2.2 基因功能富集分析

通過 Metascape(www.metascape.org/)在線基因功能富集分析工具對16個核心靶標進行基因本體論(gene ontology，GO)和全基因組及代謝途徑(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集分析，設定分析的物種為“智人”，其他選項設定默認，選擇P值≤0.01進行個性化分析。根據數據信息，選擇按照P值升序排列的前15條基因功能，以名稱與富集因子使用微生信(http://www.bioinformatics.com.cn/)網站可視化作圖得到分子生物學功能(molecular function，MF)、生物學過程(biological process，BP)和細胞學組分(cellular components，CC)的柱狀圖，選擇按照P值升序排列前15條的基因通路制作KEGG通路氣泡圖。

2.2.2.1 靶標的GO功能注釋

GO功能注釋結果見圖7，包括16個核心靶標的BP(332條)、CC(29條)和MF(35條)的富集結果。柱狀圖縱坐標為count，以不同的顏色區分GO注釋的三大功能。因條目數量過多，每個功能注釋僅展示p值最小前15的條目，見圖7。主要涉及水解酶活性正向調節、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號通路、酶聯受體蛋白信號通路、細胞的激活、造血或淋巴器官的發育、免疫系統生長、蛋白質磷酸化、peptidyl-tyrosine磷酸化、peptidyl-tyrosine改變、對生長因子的響應、對無機物的反應、白細胞激活、細胞對有機氮化合物的反應、細胞對氮化合物的反應、蛋白質磷酸化的正向調節、膜筏、microdomain、細胞質的核周區、神經膠質細胞投影、質膜蛋白復合物、早期內體、復雜受體、質膜細胞質側的外源性成分、膜的外部成分、囊腔、細胞前緣、粘著斑、細胞基質結、質膜外源成分、質膜的細胞質側、蛋白質酪氨酸激酶活性、蛋白質絲氨酸/蘇氨酸/酪氨酸激酶活性、蛋白激酶活性、醇基受體磷酸轉移酶活性、激酶活性、酶激活活動、磷酸酶綁定、非跨膜蛋白酪氨酸激酶活性、磷脂酶激活活動、鏈接蛋白結合、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、激酶綁定、脂肪酶催化劑活性、磷脂酶結合、蛋白磷酸酶綁定等生物活動。

圖7 GO功能注釋柱狀圖Fig.7 The bar graph of GO function enrichment analysis

2.2.2.2 靶標信號通路富集分析

對山銀花的16個核心靶標的通路富集分析如圖8(僅展示p值最小的15條)所示，圖中點的大小代表count，顏色深淺代表-log10(P)，橫坐標代表GeneRatio，結果表明主要涉及癌癥通路、癌癥蛋白聚糖通路、PD-L1在癌癥中的表達和PD-1檢查點通路、卡波濟肉瘤相關皰疹病毒感染、內分泌的阻力、粘著斑、破骨細胞分化、自然殺傷細胞介導的細胞毒性、雌激素信號通路、乳腺癌、丙型肝炎、非小細胞肺癌、乙型肝炎、胰腺癌、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥等115條信號通路。

圖8 靶標信號通路富集分析氣泡圖Fig.8 The bubble chart of KEGG function enrichment analysis

2.2.3 化合物-靶標-通路網絡構建與分析

將上述分析得到115個通路及16個關鍵靶標與對應的化合物數據導入Cytoscape 3.8.2軟件構建“化合物-靶標-通路”網絡，如圖9所示[12]。圖中外面兩層藍色圓點為115個通路，最內層紅色圓點為8個潛在質量標志物，次內層綠色遠點為16個核心靶點。

圖9 化合物-靶標-通路網絡圖Fig.9 Compound-target-pathway network diagram

2.2.4 分子對接驗證

根據上述網絡藥理學結果結合考量山銀花功效，選擇STAT3、EGFR、MAPK1及PIK3CA作為分子對接驗證的靶標蛋白，從PDB數據庫中下載STAT3(ID:5AX3 配體：5ID)、EGFR(ID:6JRK 配體：C6O)、MAPK1(ID:TAUV 配體：RYW)及PIK3CA(ID:3ZIM 配體：KKR)結構，從ZINC數據庫下載8個潛在質量標志物化合物的mol2格式，使用Schr?dinger軟件中的Protein Preparation wizard模塊對蛋白質進行補足缺失殘基以及中性化等操作，最后進行能量最小化并添加OPLS4力場，使用Receptor Grid Generation模塊根據原有配體默認生成Grid文件，采用Schr?dinger的LigPrep模塊對各分子進行加氫、能量最小化、幾何優化等處理，在OPLS4的力場下，將蛋白質與化合物對接，并將打分結果與原配體化合物進行對比[13]，對接結果見表5，對接結合見圖10。8個化合物與蛋白質對接后docking score均<0，93.75%的化合物docking score<-5且與原活性化合物對接結果相近，證明8個成分與靶點對接效果良好。

表5 成分與關鍵靶蛋白的分子對接結果Table 5 Binding result of components with its key targets

圖10 EGFR蛋白與獐芽菜苷(A)、灰氈毛忍冬皂苷乙(B)對接圖Fig.10 Docking diagram of EGFR protein with sweroside (a) and macranthoidin B (b)

2.3 化學可測性分析

2.3.1 方法學考察

2.3.1.1 標準曲線的繪制

取對照品溶液，70%甲醇等比稀釋新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐芽菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙溶液，經0.45 μm微孔濾膜過濾，密封，低溫避光保存，備用。精密吸取各濃度對照溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，按“2.1.1”項色譜條件測定，以對照品濃度(mg/mL)為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線，8種化學成分線性回歸方程見表6。

表6 山銀花中8種化學成分線性回歸方程Table 6 Linear regression equations of eight chemical constituents of Lonicerae Flos

從表6可知，新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙線性關系良好。

2.3.1.2 精密度實驗

取S20號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在該項色譜條件下連續進樣6次，記錄色譜圖。測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙峰面積的RSD分別為2.42%、0.32%、0.99%、1.18%、2.34%、0.24%、1.45%、0.93%，表明儀器精密度良好。

2.3.1.3 穩定性實驗

精密稱取S20號樣品，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在該項色譜條件下，分別于0、4、8、12、18、24 h進樣，進行色譜分析，記錄色譜圖。測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙峰面積的RSD分別為2.99%、0.44%、2.20%、2.47%、2.65%、0.37%、1.83%、0.92%，表明供試品溶液在24 h內穩定性良好。

2.3.1.4 重復性實驗

精密稱取S20號樣品6份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在該項色譜條件下進樣，記錄色譜圖。測得新綠原酸、綠原酸、咖啡酸、獐牙菜苷、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙、川續斷皂苷乙峰面積的RSD分別為1.98%、1.86%、1.56%、2.26%、2.52%、1.47%、2.29%、1.22%，表明該方法重復性良好。

2.3.1.5 加樣回收實驗

精密稱定已知含量的對應山銀花樣品6份，分別精密加入適量對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按照2.1.1項色譜條件下進樣，記錄色譜圖，計算加樣回收率。結果表明新綠原酸的平均回收率為102.84%(RSD=2.28%)，綠原酸的平均回收率為96.44%(RSD=0.74%)，咖啡酸的平均回收率為100.68%(RSD=2.53%)，獐牙菜苷的平均回收率為100.28%(RSD=1.32%)，異綠原酸B的平均回收率為101.97%(RSD=0.80%)，異綠原酸A的平均回收率為99.79%(RSD=2.70%)，灰氈毛忍冬皂苷乙的平均回收率為99.71%(RSD=1.14%)，川續斷皂苷乙的平均回收率為100.38%(RSD=2.30%)，表明該方法的回收率良好。

2.3.2 含量測定

按“2.1.3”項下方法制備29批山銀花樣品供試品溶液，按“2.1.1”項色譜條件進樣，記錄色譜圖，根據表6中標準曲線進行計算，其百分含量結果見表7。

表7 山銀花樣品中8種化學成分的含量Table 7 Content of eight main components of Lonicerae Flos

2.4 基于植物親緣性的質量標志物分析

2005版《中國藥典》始將金銀花和山銀花分列，其中忍冬科忍冬干燥花蕾或帶初開的花臨床作金銀花入藥；灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬及黃褐毛忍冬干燥花蕾或帶初開的花臨床作山銀花使用，建立同科同屬不同種來源中藥材(金銀花和山銀花)的定性鑒別方法以確保入藥來源的準確性十分必要。Wang等[14]采用 UPLC 法測定新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙等含量，用于定性鑒別區分金銀花和山銀花；金銀花與山銀花上述成分含量不同，金銀花皂苷類成分極低不易檢測，而山銀花中皂苷類含量高；Zhang等[15]利用測定金銀花與灰氈毛忍冬中的新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A等成分的含量區分忍冬與灰氈毛忍冬。綜上所述，金銀花與山銀花在酚酸類、黃酮類及皂苷類成分含量上存在顯著差異，將新綠原酸、綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、灰氈毛忍冬皂苷乙和川續斷皂苷乙等作為山銀花的質量標志物能夠區別不同來源“銀花”。

3 討論與結論

3.1 基于化學成分可測性對質量標志物討論

本文通過HPLC建立了山銀花的指紋圖譜，29批山銀花樣品間相似度>0.95，方法學考察結果證明HPLC指紋圖譜穩定可靠。對山銀花進行潛在質量標志物的含量測定，結果表明，所有樣品以上8種成分均可檢測，且所有樣品綠原酸、灰氈毛忍冬皂苷乙及川續斷皂苷乙成分含量都遠高于藥典標準，表明湖南產不同規格山銀花質量均良好。HCA分析結果表明，在分類距離為20時，除18號樣品外，其他樣品按加工方式聚成兩大類(蒸汽殺青、低溫干燥)；在分類距離為6時，除1、27、13、18外其他樣品按照品種與加工方式的不同聚成4類(蒸汽殺青湘蕾、蒸汽殺青五彩花、低溫干燥湘蕾、低溫干燥五彩花)。其中，1、27是蒸汽殺青湘蕾但與低溫干燥湘蕾在HCA分析中分類距離更近，18是蒸汽殺青的五彩花在分類學上與低溫干燥五彩花分類更近，13是蒸汽殺青湘蕾與蒸汽殺青五彩花分類更近，提示加工方法對藥材品質有較大的影響。

3.2 基于有效性對質量標志物討論

山銀花入藥時其味甘，寒，歸肺、心、胃經，具清熱解毒，疏散風熱功效。現代研究表明，甘味[16]與皂苷、維生素、蛋白質、甾醇及氨基酸等成分有關，清熱解毒、疏散風熱與現代研究中的抗炎抗菌增強免疫等反應有關。運用網絡藥理學從有效性角度分析發現，咖啡酸、獐牙菜苷等八種化合物通過調控STAT3、EGFR、MAPK1、APP、PIK3CA、ITGB1、CASP3等16個關鍵靶點，作用于能量代謝、神經遞質傳遞、炎癥反應等生理過程，與其清熱解毒、疏散風熱的傳統功效相關。

深入分析相關靶點可以發現，炎癥反應的靶點尤其多，以STAT3與EGFR靶點為例 。STAT3靶點全稱Signal Transducer And Activator Of Transcription 3，信號轉換器與轉錄激活器[18]。STAT家族成員作為細胞因子和生長因子[18]，該蛋白可被各種細胞因子和生長因子磷酸化激活，包括EGF、IL5、IL6、HGF、LIF和BMP2[18]。EGFR靶點全稱表皮生長因子受體，該蛋白是表皮生長因子家族成員的受體[17]。EGFR誘導受體二聚化和酪氨酸自磷酸化，導致細胞增殖[18]。EGFR是導致新冠病毒(COVID-19)由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型(SARS-CoV-2)感染引起的嚴重形式的細胞因子風暴的組成部分[18,19]。研究證實，上述靶點確為肺部相關感染中表現突出的靶點，與山銀花的傳統性味歸經一致。

文獻表明咖啡酸通過NF-kB依賴性途徑抑制TNF-α和PGE2的產生，提高巨噬細胞的細菌清除活性[20]，抑制AGE的形成，調節腸道炎癥[21]，降低血清和腎臟中ACE和精氨酸酶活性、降低MDA和升高NOx水平來抗高血壓[21]，阻斷STAT3和抑制MMP2和MMP-9，阻止ROS的產生以及減少腫瘤細胞血管生成來起抗肝癌作用[22]，激活JNK/Bcl-2介導的體外自噬降低A53Tα-突觸核蛋白改善帕金森病行為并保護多巴胺能神經元[23]，降低氧化應激改善血脂水平，減少主動脈損傷抗動脈粥樣硬化[24]。獐芽菜苷能通過上調miR-29a、抑制col1和TIMP1發揮抗肝纖維化作用[25]，抑制NLRP3炎癥體的激活預防非酒精性脂肪性肝炎[26,27]，誘導肝癌細胞Akt磷酸化并抑制Pck1表達來抗癌[28]。通過代謝組學分析，異綠原酸A、異綠原酸B、綠原酸、新綠原酸、川續斷皂苷乙等均為山銀花的入血成分[29]，因此文獻研究結果與網絡藥理學研究證明以上8個潛在質量標志物確為山銀花發揮藥效的物質基礎。

綜上，本研究基于HPLC指紋圖譜結合聚類分析可有效區分不同品種與加工方式的山銀花；本研究基于OPLS-DA分析結果，結合網絡藥理學闡明了綠原酸、異綠原酸A、新綠原酸、獐芽菜苷、異綠原酸B、灰氈毛忍冬皂苷乙、咖啡酸、川續斷皂苷乙8個化合物可作為山銀花質量標志物，其為進一步建立提升山銀花質量標準提供了參考。