基于改進熵權法結合TOPSIS模型和BPNN建模優化甘草多糖醇沉工藝

何寶峰，馬新換，馬忠祥，王寶才，徐志偉，馬芳兄，楊天艷，李榮焜

1甘肅中醫藥大學；2甘肅省第二人民醫院，蘭州 730000；3甘肅省中醫院，蘭州 730050

據文獻報道，甘草多糖是甘草主要藥效成分之一，有抗腫瘤、抗炎、抗病毒、免疫調節等生理活性，已成為深入挖掘甘草藥理活性成分的研究熱點，目前對甘草多糖的研究以提取工藝、純化技術和藥理活性研究為主[1]。研究表明，水溶性甘草多糖是一種多成分、分子結構高度支化且連接有蛋白質的雜多糖[2]。藥理研究發現，純化多糖藥理活性不及粗多糖，推測化學試劑的加入、純化步驟繁雜、蛋白質損失是主要原因[3,4]，本文將圍繞甘草中水溶性成分甘草多糖進行醇沉工藝優化研究。

信息熵理論作為一種客觀賦權法廣泛應用于中藥及復方提取工藝涉及多指標的優化研究中[5]，而傳統熵權法的熵權值大于0.5時，個別數據的變化會引起權重的成倍變化[6]，從而影響工藝參數的確定，因此本文采用改進熵權法處理，能有效克服其存在的缺陷，提高決策準確性，所得數據更可靠，結果更科學合理。TOPSIS法以評價對象與理想化目標接近程度為依據對實驗方案進行排序，將多指標轉化為綜合指標，是一種能集中反映樣本總體情況的多指標決策分析方法[7]。近年來將廣大學者將TOPSIS法與熵權法結合，對評價指標進行權重賦值，從而綜合評價試驗方案，可有效避免人為因素對試驗結果的主觀干預，使評價結果更客觀全面，該方法已廣泛用于中藥質量綜合評價中[8]，適用于本研究的工藝優化問題。BP神經網絡(back propagation neural network，BPNN)能打破正交設計、星點設計等常規試驗設計在已設水平優選最佳參數的局限性，通過模擬人腦神經系統對復雜信息的處理方式，進而建立一種數學模型，用以對復雜非線性關系的研究[9-11]。

通過查閱文獻發現[12-14]，醇沉時間、乙醇體積分數、濃縮液相對密度對多糖的醇沉效果影響比較大。因此本課題組以甘草多糖、單糖、總糖含量及提取量為評價指標，利用改進熵權法與熵權TOPSIS法處理試驗數據，對甘草多糖醇沉的主要因素進行研究，比較兩種分析方法在正交設計中的適用性，確定最佳醇沉工藝，再利用BP神經網絡建模進行仿真尋優，尋求甘草多糖最佳醇沉工藝參數，以期為甘草多糖制備優選出穩定可行的醇沉工藝，為其進一步開發利用及綜合質量控制提供科學依據。

1 儀器與材料

UV-2 700紫外可見光分度計(島津企業管理有限公司)；DZF-300真空干燥箱(鄭州長城科工貿有限公司)；AR522CN型電子天平(奧豪斯儀器有限公司)；EP125SM型電子分析天平、LX120A型電子分析天平(瑞士Dietikon公司)；DL-1 000萬用電子爐(上海科恒實業發展有限公司)；LA753純化水機(威立雅)。

苯酚(批號：20 051 121，純度≥99.0%)購自天津市天新精細化開發中心；氫氧化鈉(批號：200 928，純度≥98.0%)、硫酸(批號：170 807，純度：95.0%～98.0%)、酒石酸鉀鈉(批號：200 926，純度≥98.0%)，均購自白銀良友化學試劑有限公司；亞硫酸氫鈉(批號：20 120 329，純度≥98.0%)、3,5-二硝基水楊酸(批號：20 190 601，純度≥98.0%)，均購自天津市大茂化學試劑廠；D-無水葡萄糖標準品(批號110 833-201 908，純度：99.8%)購自中國食品藥品檢定研究院；提取用水為自來水，測定用水為超純水。其他試劑均為分析純。

甘草飲片由甘肅青茂農業科技股份有限公司提供，經甘肅省第二人民醫院馬新換主任中藥師鑒定為豆科甘草屬植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根和根莖。

2 方法與結果

2.1 提取方法

稱取甘草飲片50 g裝于1 000 mL圓底燒瓶中，加10倍量自來水煎煮兩次，第一次浸泡2 h，煎煮2 h，合并煎液，用無紡布過濾，靜置至提取液澄清，取上清液濃縮至75 mL，放至室溫后快速攪拌加入95%乙醇至體積分數為70%，6 ℃靜置過夜，抽濾，于0.03～0.04 MPa、80 ℃真空干燥得到甘草多糖，研細備用。

2.2 指標成分測定

2.2.1 對照品溶液制備

取在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對照品約25.00 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加超純水溶解后稀釋至刻度，搖勻，制成1.01 mg/mL葡萄糖對照品溶液。

2.2.2 測定單糖用溶液制備

取供試品約200.00 mg，精密稱定，置50 mL三角瓶中，加30 ml超純水，50 ℃水浴1 h，冷卻至室溫，轉移至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，收集續濾液即得。

2.2.3 測定總糖用溶液制備

取供試品約20.00 mg，精密稱定，至50 mL三角瓶中，加20 mL超純水，5 mL硫酸(取18 mL濃硫酸稀釋定容至100 mL)，搖勻，在沸水浴中水解60 min，冷卻至室溫，加數滴酚酞指示劑，加10 mol/L氫氧化鈉溶液3.00 mL，用10%氫氧化鈉溶液滴至中性(粉紅色)，轉移至50 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過，收集續濾液即得。

2.2.4 含量測定方法

精密量取上述對照品和供試品溶液各2.00 mL，置于10 mL具塞試管中，加3,5-二硝基水楊酸(DNS)顯色液1.50 mL，振搖均勻，在沸水浴中反應15 min，取出，冷卻至室溫后用超純水轉移至25 mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻。照分光光度法(《中國藥典》2020年版四部通則0 401)在490 nm波長處測定吸光度值，以超純水為隨行空白，重復測定3次取平均值，利用回歸方程計算得到樣品溶液中葡萄糖折合濃度，按照公式(1)、(2)計算各糖含量。

(1)

多糖含量=總糖含量-單糖含量

(2)

式中：C為樣品溶液中葡萄糖折合濃度(μg/mL)；V為樣品溶液總體積(mL)；n為稀釋倍數；M為供試品重量(mg)。

2.2.5 標準曲線制作

以“2.2.1”項下配制的葡萄糖對照品溶液為母液，分別精密吸取母液0.00、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25 mL，加超純水補足至2.00 mL，再滴加DNS顯色1.50 mL，配制成濃度為0.00、10.10、20.20、30.30、40.40、50.50 μg/mL標品溶液，按照“2.2.4”項下方法配制測定液，并測定各溶液吸光度值。以葡萄糖質量濃度(C)為橫坐標，吸光度(A)為縱坐標繪制葡萄糖標準曲線，得回歸方程為A=0.026 8C-0.031 9，r=0.998 3，表明葡萄糖在0.00～50.50 μg/mL范圍內線性關系良好。

2.2.6 方法學考察

2.2.6.1 精密度考察

取同一批甘草多糖粉末，精密稱定，按照“2.2.2”與“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法測定供試品吸光度，連續測定6次，記錄吸光度值，RSD為0.13%，表明儀器精密度良好。

2.2.6.2 重復性考察

取同一批甘草多糖粉末，精密稱定，按照“2.2.2”與“2.2.3”項下方法制備6份測定液，按“2.2.4”項下方法測定供試品吸光度值，RSD為1.28%，表明該方法重復性良好。

2.2.6.3 穩定性考察

取同一批甘草多糖粉末，精密稱定，按照“2.2.2”與“2.2.3”項下方法制備測定液，按“2.2.4”項下方法分別在0、30、60、90、120 min測定供試品吸光度，RSD為0.56%，表明顯色后溶液在2 h內穩定性良好。

2.2.6.4 加樣回收率考察

取已知單糖含量和總糖含量的同一批甘草多糖粉末，平行6份，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，分別加入等比例葡萄糖對照品0.08、0.40 mg，按照“2.2.2”與“2.2.3”項下方法分別制備供試品溶液，按“2.2.4”項下方法測定供試品吸光度，計算單糖和總糖的加樣回收率，平均加樣回收率分別為98.43%、98.02%，RSD分別為0.59%、0.78%。

2.3 單因素試驗

2.3.1 濃縮比對甘草多糖的影響

稱取甘草飲片50 g，按照“2.1”項下方法提取，將提取液分別濃縮至1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/g(即濃縮液體積與甘草飲片質量之比)，放至室溫后，調節乙醇體積分數為70%，醇沉20 h。結果顯示(見表1)，提取量隨濃縮比增大而下降，單糖含量變化不明顯，總糖和多糖含量反而升高，說明濃縮比越小高溫加熱時間越長，總糖和多糖分解越多，濃縮比過大溶液濃度較低則不利于多糖析出，導致提取量降低。因此，綜合實際生產因素和成本，選取1.5、2.0、2.5 mL/g三個水平進行優化試驗。

表1 濃縮比對甘草多糖的影響Table 1 Effect of concentration ratio on G. uralensis polysaccharides

續表1(Continued Tab.1)

2.3.2 乙醇體積分數對甘草多糖的影響

稱取甘草飲片50 g，按照“2.1”項下方法提取，將提取液濃縮至1.5 mL/g，放至室溫后，加95%乙醇分別調節乙醇體積分數為60%、65%、70%、75%、80%，醇沉20 h。結果顯示(見表2)，提取量隨乙醇體積分數增大而呈上升趨勢，單糖含量和多糖含量變化不明顯，當乙醇體積分數大于75%時總糖含量明顯降低，說明隨著乙醇體積分數的增大藥液中含有的無機鹽等雜質易被沉淀析出，不利于總糖沉淀，導致糖含量降低，綜合實際生產因素選取65%、70%、75%三個水平進行優化試驗。

表2 乙醇體積分數對甘草多糖的影響Table 2 Effect of ethanol volume fraction on G. uralensis polysaccharides

2.3.3 醇沉時間對甘草多糖的影響

稱取甘草飲片50 g，按照“2.1”項下方法提取，將提取液濃縮至1.5 mL/g，放至室溫后快速攪拌加入95%乙醇，調節乙醇體積分數為70%，分別醇沉4、8、12、16、20 h。結果顯示(見表3)，提取量隨醇沉時間的延長變化不明顯，單糖含量先升高后下降，總糖和多糖含量呈現上升趨勢，說明醇沉時間短，多糖不能完全析出，隨著時間延長，沉淀析出更充分，結合實際生產過程確定以12、16、20 h三個水平進行優化試驗。

表3 醇沉時間對甘草多糖的影響Table 3 Effect of alcohol precipitation time on G. uralensis polysaccharides

2.4 正交試驗優選甘草多糖醇沉工藝

2.4.1 試驗設計

以單因素試驗考察結果為依據，選用濃縮比(A)、乙醇體積分數(B)、醇沉時間(C)為考察因素，以提取量、單糖、總糖和多糖含量為評價指標，利用L9(34)正交表安排試驗，因素水平見表4，優選甘草多糖醇沉工藝。試驗安排及各指標測定結果見表5。

表4 正交試驗因素水平Table 4 Orthogonal test factor level

表5 正交試驗設計及指標測定結果Table 5 Orthogonal test design and index determination results

2.4.2 數據處理

采用改進熵權-TOPSIS法處理多指標數據[15,16]。該方法對樣本無特殊要求，分析簡便，能有效規避實驗者的主觀偏好性，提高試驗結果的可靠性和科學性，適用于有限方案多目標決策分析[17]。

2.4.2.1 歸一化處理

以試驗號為組別，甘草多糖提取量和各成分含量為指標建立評價正交各試驗組合甘草多糖品質的初始化決策矩陣，本試驗要求各指標越大越好，因此采用指標越大越優型公式(3)進行歸一化數據處理，結果見表6。

表6 決策矩陣歸一化結果Table 6 Normalization results of decision matrix

Xij=(Xij-Xmin)/(Xmax-Xmin)

(3)

2.4.2.2 加權決策矩陣構建

根據公式(4)、(5)、(6)計算各評價指標的熵權值，提取量、單糖含量、總糖含量及多糖含量的熵權分別為0.252 1、0.253 1、0.246 4、0.248 4，將決策矩陣歸一化結果與各評價指標熵權相乘，得到加權決策矩陣，結果見表7。

表7 加權決策矩陣結果Table 7 Weighted decision matrix results

(4)

(5)

(6)

2.4.2.3 歐式貼近度計算及評價

根據公式(7)、(8)確定加權決策矩陣的最優向量和最劣向量，再根據公式(9)、(10)、(11)計算各評價指標與正負理想解的距離及各指標對最優解的歐式貼近度，最終確定各試驗號甘草多糖品質的綜合排序，結果見表8。

表8 正交設計優劣評價及排序Table 8 Evaluation and ranking of orthogonal design

V+=max(R1j,R2j…...Rnj)

(7)

V-=min(R1j,R2j......Rnj)

(8)

(9)

(10)

(11)

2.4.3 正交設計結果

分別采用改進熵權綜合評分法和改進熵權-TOPSIS法處理正交結果，利用公式(12)計算各指標綜合評分(M)結果見表9，方差分析見表10。

表9 正交設計熵權-TOPSIS法結果Table 9 Results of orthogonal design entropy weight-TOPSIS method

表10 方差分析結果Table 10 Results of analysis of variance

M=提取量×0.252 1+單糖含量×0.253 1+總糖含量×0.246 4+多糖含量×0.248 4

(12)

正交試驗結果顯示，甘草多糖醇沉影響因素結果為：濃縮比>醇沉時間>乙醇體積分數，其中單用改進熵權法處理數據，所得結果極差與誤差都較大，而改進熵權與TOPSIS法聯用所得結果極差和誤差均較小，說明改進熵權-TOPSIS法能充分利用原始數據的信息，準確反映各評價方案之間的差距，能對正交試驗結果進行綜合評價以獲得最優參數組合，規避優化過程中的人為主觀因素，提高決策準確性、科學性，使所得結果更可靠。由此可見醇沉時間和濃縮比對甘草多糖醇沉影響較大，乙醇體積分數對醇沉影響較小。最終優選得到最佳醇沉結果為A3B2C3，即濃縮比為2.5 mL/g，乙醇體積分數為70%，醇沉時間為20 h。

2.5 BP神經網絡仿真尋優

本實驗使用Matlab R2012a軟件進行BP神經網絡模型構建[18,19]。輸入層為濃縮比、乙醇積分數、醇沉時間，輸出層為各指標賦權后計算得到的綜合評分，隱藏節點為10，訓練函數、學習函數、激活函數均為該軟件默認值，構建3-10-1型BP神經網絡模型。將表9中數據采用留一交叉法進行訓練，然后將所有數據作為訓練集和驗證集，通過誤差值對模型進行評估，9組數據的預測誤差分別為0.000 8、0.000 4、0.005 0、0.000 5、0.002 3、0.003 1、0.000 9、0.577 1、0.032 7，平均值為0.069 2，具有顯著性，表明模型精度較好。由圖1A可知，當迭代次數為2時網絡驗證性能達到最好，均方誤差值為0.000 852 1。再將試驗數據預測值與實測值進行比較(圖1B)，表明所建模型穩定可靠，可用于甘草多糖醇沉工藝優化。

圖1 BP神經網絡可靠性驗證Fig.1 Reliability verification of back propagation neural network

再以表9數據作為訓練集，按照上述建模條件對綜合評分進行預測。在正交試驗參數基礎上，設置濃縮比為1.0～2.5 mL/g(步長0.25)，乙醇質量分數65%～75%(步長1)，醇沉時間12～24 h(步長2)，對539個試驗組合通過所建網絡模型計算綜合評分，預測綜合評分結果見表11。BP神經網絡預測結果表明，隨著濃縮比的升高，預測評分逐漸增大，當醇沉時間固定為24 h，濃縮比在2.0～2.5 mL/g范圍，乙醇質量分數在66%～71%范圍內，預測綜合評分具有最高值，且各最高值變化不明顯。考慮到生產成本，確定最佳醇沉工藝為濃縮比2.0 mL/g、乙醇體積分數67%，醇沉時間24 h。

表11 BP神經網絡預測評分Table 11 back-propagation neural network prediction score

續表11(Continued Tab.11)

2.6 工藝驗證

稱取甘草飲片6份，分別采用正交設計和BP神經網絡優選的最佳醇沉工藝制備甘草多糖，各指標結果見表12。可見正交設計平均綜合評分值為25.790 3，RSD為1.68%，BP神經網絡平均綜合評分值為25.025 9，預測值為24.156 2，RSD為1.36%。綜上所述，BP神經網絡優化所得最佳工藝檢驗值略低于正交設計優化結果，二者差距較小，且BP神經網絡相對誤差較小，擬合效果更好。為減少乙醇使用量，降低生產成本，最終確定甘草多糖醇沉工藝為濃縮比2.0 mL/g，調節乙醇體積分數至67%，醇沉24 h。

表12 工藝驗證結果Table 12 Process verification results

3 討論與結論

中藥藥理作用的發揮是多成分相互協調作用的結果，而中藥提取物所含有的混合總糖共同作用使得多糖更好發揮其藥理作用，業內則有“多糖越純，活性越低”的觀點[20]。既往文獻對甘草中多糖的提取醇沉工藝考察多以提取量和多糖含量(或得率)為指標來評價，其優化結果難以反映多糖復雜的內在本質，現有研究多以甘草粉末為提取原料，后期對所得粗多糖均需經Savage法、乙醚、丙酮、甲醇等化學試劑法除雜，除雜過程所用試劑對人體損傷較大，前期粉碎處理、乙醇或乙醚脫脂等過程不但增加生產成本，耗費時間，而且嚴重危害操作人員的身心健康，且除雜、脫脂所用化學試劑多在中藥制劑生產中屬于禁用試劑。因此本研究為優化甘草多糖醇沉工藝，以甘草飲片為研究對象，在單因素試驗基礎上，選取主要因素濃縮比、醇沉時間、乙醇體積分數，以甘草多糖、總糖、單糖含量和提取量為評價指標，采用改進熵權法聯用TOPSIS模型法處理正交試驗數據，并利用BPNN建模仿真尋優進行工藝優選。比較單用改進熵權法和改進熵權聯用TOPSIS法結果發現，改進熵權-TOPSIS法能充分利用原始數據信息，對正交試驗結果進行綜合評價以獲得最優參數組合，可有效規避優化過程中人為主觀因素，提高決策準確性、科學性，使所得結果更可靠，最終確定甘草多糖最佳醇沉工藝為將提取液濃縮至2.5 mL/g，調節乙醇體積分數為70%，醇沉20 h。

在正交試驗基礎上采用Matlab12.0軟件構建BP神經網絡模型，通過對正交試驗數據學習訓練，得到精度較好、穩定可靠的網絡模型，利用sim函數仿真尋優，得到最佳工藝為將提取液濃縮至2.0 mL/g，調節乙醇體積分數為67%，醇沉24 h。經過工藝驗證發現，BPNN建模尋優結果綜合評分略低于綜合評分法進和改進熵權-TOPSIS法，但其RSD值較小，BP神經網絡具有較強自主學習能力，所得工藝更加穩定，因此確定BPNN建模尋優結果為甘草多糖醇沉最佳工藝。

本試驗通過單因素研究確定甘草多糖醇沉影響因素水平，以正交設計安排試驗，運用改進熵權法處理試驗數據，克服傳統熵權法某一指標熵權值細微變化引起相應權重成倍變化的缺陷。選取多個指標綜合評價以優化甘草多糖醇沉工藝，通過比較綜合評分法和改進熵權-TOPSIS法結果，確定影響甘草多糖醇沉因素的重要程度，利用BP神經網絡對正交參數學習訓練后進行仿真尋優，在不增加試驗次數的情況下，對非線性問題進行建模尋優，彌補既往優化試驗的不足，所得工藝參數更加科學可靠，可為甘草多糖進一步開發研究和規模化生產提供客觀依據，并為相關工藝優化問題提供新思路。