基于網絡藥理學和實驗驗證探討光甘草定治療去勢抵抗性前列腺癌的作用機制

譚武賓，周 松，康 海，蔣湘勇，毛 正，楊 科，李鐵求*

1湖南省人民醫院(湖南師范大學附屬第一醫院)，長沙 410002；2長沙縣人民醫院(湖南省人民醫院星沙院區)，長沙 410100

前列腺癌(prostate cancer，PCa)是老年男性生殖系統腫瘤中最常見的惡性腫瘤，許多早期對雄激素剝奪治療有效，但大多數終將從激素敏感性前列腺癌進展為去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC)[1,2]。CRPC是一種致死率較高、且具有高度侵襲性的前列腺癌,有超過84%的CRPC患者會發生轉移，其生存中位數只有20個月左右[3,4]。雖然近幾年新型化療藥、內分泌藥物的出現，但這些化療藥物存在諸多副作用，且內分泌藥物存在耐藥的問題，使得藥物作用時間縮短。因此，尋找新的藥物對延緩去勢抵抗的過程以及治療CRPC具有重要意義。

光甘草定(glabridin)是一種從甘草中提取出的異黃酮類化合物，具有廣泛的生物學活性，如抗炎、抗氧化、抗腫瘤、神經保護、抗骨質疏松癥等[5]。據報道，光甘草定在乳腺癌中[6]、肝癌[7]、胃癌[8]、宮頸癌[9]中表現出良好的抑制腫瘤細胞增殖、誘導凋亡的作用。然而，光甘草定對CRPC的分子機制尚未完全明確。網絡藥理學是依托系統生物學，將藥理學、計算機科學和信息網絡相結合的方式，為復雜疾病的藥物發現和選擇提供了新的思路[10]。為進一步探究光甘草定對CRPC的作用機制，我們采用網絡藥理學、分子對接以及細胞實驗的方法探討其作用機制，為今后的藥物基礎研究和臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 藥物治療靶點的預測

利用多個中藥數據庫盡可能全面收集光甘草定治療靶點，截止時間為2021年10月25日，在HERB數據庫(http://herb.ac.cn/)、TCMIO數據庫(http://tcmio.xielab.net/)、TCMSP數據庫(https://tcmsp-e.com/)輸入“Glabridin”收集靶點，在PharmMapper數據庫(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/index.html)中上傳光甘草定的mol2格式文件，選擇“Human Protein Targets Only (v2010,2241)”預測治療靶點，在BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/index.php/Home/Index/index)中輸入光甘草定的“PubChem_CID/InChI”進行預測，收集“Score cutoff>= 20”的預測靶點，在Swiss Target Prediction數據庫(http://www.swisstargetprediction.ch/)輸入光甘草定的“SMILES”預測治療靶點，利用Uniprot數據庫(https://www.uniprot.org/)進行靶點的校正并去重。

1.2 疾病相關基因的收集

在DisGeNET數據庫(https://www.disgenet.org/)中輸入關鍵詞“castration resistant prostate cancer”，去除重復靶基因后收集CRPC相關的靶基因。隨后，利用韋恩圖工具(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)將光甘草定治療靶點映射到CRPC靶基因中獲得藥物-疾病共同靶點。通過建立各靶點節點、類型文件，依次輸入到Cytoscape 3.7.2軟件中構建藥物-靶點-疾病網絡圖。

1.3 蛋白互作網絡分析及核心靶點的篩選

將以上共同靶點蛋白輸入到“STRING”數據庫(https://string-db.org/)中，Organism選擇“Homo sapiens”，最低交互分數“minimum required interaction score”設置為0.400，將結果以 TSV格式下載保存，運行Cytoscape 3.7.2軟件，導入下載文件,使用CytoHubba插件進行網絡拓撲學分析，獲得各靶點之間的連接度(degree值)，根據degree值大小獲得光甘草定治療CRPC的核心靶點，并在軟件中通過調節各節點顏色、大小等步驟制作蛋白-蛋白互作分析(PPI)網絡圖。

1.4 GO基因本體和KEGG通路富集分析

使用R studio中的bitr函數進行蛋白ID與基因ID的轉換，注釋包為 “org.Hs.eg.db”包，將ID名稱轉換為標準的基因編號(ENTREZ ID)，并使用“clusterProfiler”“ggplot2”軟件包(R 3.6.3 for Windows)進行GO功能富集分析，包括生物學過程(biological process，BP)、細胞學組分(cytological component，CC)、分子生物學功能(molecular function，MF)和KEGG通路富集分析[11]。設置P<0.01為具有統計學意義的富集結果，將結果以柱形圖和氣泡圖展示。

1.5 分子對接分析方法

在PDB數據庫(https://www.rcsb.org/)下載相應的蛋白的PDB文件，TCMSP數據庫(https://tcmsp-e.com/)下載光甘草定的mol2格式文件，運用PyMOL2.4.0軟件對受體蛋白進行去水、去配體等操作，AutoDockTools-1.5.6軟件對蛋白進行加氫以及計算電荷處理等處理,將受體蛋白和配體小分子分別轉化為pdbqt格式，利用插件“autogrid”及“autodock”進行活性位點對接，對接過程中使用Lamarckian genetic algorithm(LGA)算法。計算結合能(binding energy)(kJ/mol)來評估成分小分子與蛋白之間的結合活性，一般小于-5.0 kJ/mol的對接結合能被認為具有良好的結合相互作用。最后運用PyMOL2.4.0軟件展示其結構模式。

1.6 體外細胞實驗方法

1.6.1 主要藥物、試劑、儀器及細胞株

光甘草定(Glabridin，貨號：HY-N0393，純度：99.87%，購自美國MCE公司)；CCK8試劑盒(貨號C0038)購自上海碧云天公司；1640培養基(貨號C11875500BT)、胎牛血清(貨號42F7180K)、胰酶(貨號25200072)購自美國Gibco公司；膜聯蛋白V-FITC凋亡檢測試劑盒(貨號640914)購自美國Biolegend公司；DAPI染色液(貨號MBD0015)購自上海Sigma公司；Akt(貨號60203-2-Ig)、磷酸化Akt(貨號66444-1-Ig)、PI3K(貨號60225-1-Ig)、GAPDH(貨號60004-1-Ig)抗體購自湖北Proteintech公司；磷酸化PI3K抗體(貨號ab182651)購自Abcam(中國上海)；流式細胞儀來自美國貝克曼庫爾特有限公司，CO2培養箱來自美國賽默飛世爾科技公司；人前列腺癌細胞(PC-3)購自湖南豐暉細胞庫，細胞置于1640培養基培養，培養環境：含有5% CO2的37 ℃飽和濕度的培養箱。

1.6.2 藥物溶液配置

取光甘草定(分子式：C20H20O4)5mg于500 μL離心管中，在超凈臺下操作，加入308 μL二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，制備成50 mmol/L的濃縮溶液，保存在-20 ℃冰箱中。

1.6.3 細胞增殖實驗

取生長狀態良好的細胞，經胰酶消化、離心、重懸細胞，調整細胞密度為4×104個/mL，接種到96孔板中，每孔加入100 μL細胞懸液。繼續培養24 h，待細胞完全貼壁后將細胞分為4個實驗組和1個空白組，每組設置3個復孔，實驗組每孔加入含有藥物濃度梯度的培養基100 μL(25、50、75、100 μmol/L)，空白組加入不含藥物的培養基。培養24 h后棄除舊培養基，每孔加入CCK8 10 μL,繼續培養2 h，在酶聯免疫監測儀上測定各孔在450 nm波長處的光吸收值。

1.6.4 細胞凋亡檢測

將細胞以每孔5×105個/mL的密度接種到6孔板中，繼續培養24 h后，視細胞生長情況(貼壁狀態)時棄除原來的培養基，設定藥物處理組(72 μmol/L)和空白對照組(0 μmol/L)，每組安排6個復孔，依次向每孔加入2 mL相應的藥物濃度培養基，空白對照組即加入不含藥物培養基。繼續培養24 h，取每組的3個復孔細胞進行流式細胞術實驗，胰酶消化、離心、洗滌、重懸細胞，調節其濃度為1×107個/mL，然后取100 μL細胞懸浮于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入5 μL Propidium Iodide混勻，于室溫避光孵育15 min，使用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。接著取對數生長的細胞接種到24孔板中，調整細胞密度為4×104個/mL，觀察細胞80%貼壁后加入1 mL含有藥物濃度(0、72 μmol/L)的培養基繼續培養24 h，用PBS洗滌2次后用4%甲醛固定5 min，加入稀釋的DAPI染液(1 μg/mL)，室溫下避光染色20 min后用PBS洗滌3次，于熒光顯微鏡下觀察細胞形態變化。

1.6.5 目標通路相關蛋白的表達檢測

將細胞以每孔5×105個/mL的密度接種到6孔板上，用含有藥物濃度(0、72 μmol/L)的培養基繼續培養24 h后離心收集細胞，用細胞裂解液 RIPA裂解細胞，用 BCA 法測定蛋白濃度，根據蛋白質的相對分子質量大小，制備分離膠和5%的濃縮膠進行蛋白電泳分離，然后將蛋白質轉移到PVDF膜上，在室溫下，用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1 h。然后，添加以下稀釋的一抗：PI3K(1∶1 000)、p-PI3K(1∶500)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶2 000)、GAPDH(1∶5 000)，在4 ℃下孵育過夜。用PBST洗膜5次后，加入相應的二抗并在室溫下培養60 min，再次洗膜5次。均勻地滴加體積1∶1的ECL A和B混合液在膜上，將膠片暴露在暗盒中開始曝光，曝光結束后保存并導出圖片，用圖像分析軟件Image J對圖像進行灰度分析。

1.7 統計學分析

應用SPSS 25統計軟件分析處理數據，應用GraphPad Prism 8.0軟件進行作圖分析，計量資料以(Mean±SD)表示，多組均數比較使用單因素方差分析，兩組均數比較采用成組t檢驗，P<0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 藥物治療靶點以及疾病靶基因收集結果

通過檢索和收集，在HERB數據庫收集到26個，TCMIO數據庫收集到7個，TCMSP數據庫收集到24個，在PharmMapper數據庫收集到136個，在BATMAN-TCM數據庫收集到28個，在Swiss Target Prediction數據庫收集到100個，去重后得到248個藥物治療靶點。

在DisGeNET數據庫中共收集到683個具有代表性靶基因。將以上獲得光甘草定的248個預測靶點蛋白通過韋恩圖工具映射至CRPC的靶基因中獲得55個藥物-疾病共同靶點，我們將這一部分稱之為關鍵靶點蛋白/靶基因(見圖1)。將以上關鍵靶點以及藥物、疾病制作成節點信息，導入Cytoscape軟件中，繪制藥物-靶點-疾病網絡圖(見圖2)。

圖1 光甘草定與CRPC關鍵靶點韋恩圖Fig.1 Venn diagram of glabridin and CRPC key targets

圖2 藥物-靶點-疾病網絡圖Fig.2 Drug-target-disease network diagram

2.2 蛋白-蛋白相互作用網絡分析結果

將以上55個關鍵靶點蛋白輸入到“STRING”數據庫中“Multiple proteins”窗口中，Organism選擇“Homo sapiens”，最低交互分數“minimum required interaction score”設置為0.400，PPI網絡分析得出，該網絡共有55節點，440條邊，平均節點度值(average node degree)：16.0，PPI富集P值(PPI enrichmentP-value)<1.0e-16，將結果以TSV格式輸出保存。將文件導入Cytoscape軟件中，使用CytoHubba插件進行拓撲學分析，計算度值(degree值)，并繪制PPI分析網絡圖(見圖3A)，取度值大小排名前10的蛋白作為核心靶點蛋白，并根據度值大小，取排名前20制作條形圖(見圖3B)。

圖3 關鍵靶點蛋白PPI分析情況Fig.3 PPI analysis of key target proteins注：網絡圖中節點越大、顏色越深表示連接度值越高。Note:In the network diagram,the larger the node and the darker the color,the higher the connectivity value.

2.3 GO基因本體和KEGG通路富集分析結果

使用R studio中的“clusterProfiler”軟件包對以上55個靶基因進行GO富集分析和KEGG通路富集分析，GO分析富集到847個具體差異的條目(P< 0.01)，其中779條BP涉及對類固醇激素的反應(response to steroid hormone)、蛋白激酶B信號(protein kinase B signaling)、對營養水平的反應(response to nutrient levels)、蛋白激酶B信號的正向調節(positive regulation of protein kinase B signaling)等，16條CC涉及轉移酶復合物(transferase complex)、膜筏(membrane raft)、膜微結構域(membrane microdomain)、膜區(membrane region)等，52條MF涉及組蛋白脫乙酰酶結合(histone deacetylase binding)、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性(transmembrane receptor protein tyrosine kinase activity)、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性(protein serine/threonine kinase activity)、跨膜受體蛋白激酶活性(transmembrane receptor protein kinase activity)等，圖4展示了GO富集分析每一類別具有差異的前10個條目。KEGG分析富集到105個具有差異的信號通路(P< 0.01)，包括磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號通路(PI3K-Akt signaling pathway)、蛋白聚糖在癌癥中的作用(proteoglycans in cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、化學致癌-受體激活(chemical carcinogenesis-receptor activation)、內分泌的抵抗(endocrine resistance)、甲狀腺激素信號通路(thyroid hormone signaling pathway)、乳腺癌(breast cancer)、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染(kaposi sarcoma-associated herpesvirus infection)等，圖5展示了富集具有差異的前20個通路。

圖4 關鍵靶基因GO富集分析條目柱形圖(前10)Fig.4 Histogram of key target gene GO enrichment analysis items (top 10)

圖5 關鍵靶基因的KEGG通路富集分析氣泡圖(前20)Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enrichment analysis of key target genes (top 20)

2.4 分子對接結果

選擇度值排名前10的核心靶點蛋白(AKT1、TP53、ESR1、EGFR、ALB、SRC、MAPK1、CASP3、MTOR、AR)與光甘草定進行分子對接，運行AutoDock軟件分別與光甘草定共進行10次分子對接。具體對接結合能結果見表1，由表可知，所有對接結合能均<-5 kJ/mol,其中光甘草定與蛋白AKT1結合能最低，其次是SRC、TP53、EGFR，對接結合能越低表明光甘草定與這些靶點結合親和力越高，提示其有更大可能作用于以上靶點，影響靶點蛋白的結構和功能，進而調控相應的信號通路。圖6展示了光甘草定與各核心靶點的對接結構圖，由圖可知，光甘草定與核心靶點均有氫鍵相連，特別是AKT1蛋白，光甘草定與該蛋白的TRP-50殘基有苯環共軛π鍵相連，與VAL-270、HIS-207、LEU-210、ALA-212等殘基有氫鍵相連，說明光甘草定小分子與各核心靶點結合緊密，進而表明，光甘草定抗CRPC可能是通過調節以上核心靶點來實現。

表1 光甘草定與核心靶點分子對接結合能Table 1 Docking and binding energy of glabridin and core target molecules

圖6 甘草定與核心靶點的分子對接情況Fig.6 Molecular docking of glabridin with the core target

2.5 光甘草定抑制前列腺癌PC-3細胞增殖

通過細胞增殖CCK8實驗觀察不同濃度的光甘草定處理PC-3細胞24、48 h后的細胞活力情況，結果發現與對照組相比，光甘草定對PC-3細胞呈現出明顯的抑制增殖作用(P<0.05)，在50～100 μmol/L范圍內，細胞增殖抑制率在24 h內可達50%以上，計算24、48 h時間點的半數有效抑制濃度IC50分別為72、66.9 μmol/L(見圖7)。

圖7 CCK8法檢測不同濃度光甘草定對PC-3細胞的存活率的影響Fig.7 Effects of different concentrations of glabridin on the survival rate of PC-3 cells detected by CCK8 method注：與空白組比較，*P<0.05。Note:Compared with blank group,*P<0.05.

2.6 光甘草定誘導前列腺癌PC-3細胞凋亡

通過流式細胞術測定細胞凋亡率的變化，如圖8A所示，藥物處理組和對照組的細胞凋亡率分別為(6.9±0.31)%、(2.87±0.23)%，藥物處理組細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)。通過顯微鏡下觀察細胞凋亡形態變化，光甘草定處理后的細胞數量變少、體積變小、形態皺縮、細胞破裂增加。進一步通過熒光顯微鏡(200×)下觀察DAPI染色后細胞核形態變化，光甘草定處理后部分細胞核出現折縫樣改變且染色質濃縮，呈現出熒光表達增強(見圖8B)。結果表明，光甘草定在一定程度上可誘導PC-3細胞凋亡。

圖8 光甘草定作用PC-3細胞24 h后細胞凋亡情況的變化Fig.8 Apoptotic changes of PC-3 cells treated with glabridin for 24 h注：圖8A：LL為活細胞，LR為早期凋亡細胞，UR為晚期凋亡和死亡細胞，UL為碎片及損傷細胞，常規凋亡率可計算UR+LR；與空白組比較，*P<0.05。Note:Fig.8A:LL is living cells,LR is early apoptotic cells,UR is late apoptotic and dead cells,UL is debris and injured cells.The common apoptosis rate can be calculated as UR+LR;compared with blank group,*P<0.05.

2.7 光甘草定抑制蛋白AKT的磷酸化

通過Western blot方法檢測該通路相關蛋白(PI3K、AKT、p-PI3K、p- AKT)的表達情況。結果顯示，72 μmol/L光甘草定作用于PC-3細胞24 h后，磷酸化的AKT蛋白的表達較未處理組相比顯著降低(P<0.05)，總的AKT的表達量未發生明顯變化，但磷酸化的PI3K蛋白和總的PI3K蛋白變化不明顯(見圖9)。結果表明光甘草定能明顯抑制AKT蛋白的磷酸化水平，這提示光甘草定可能通過調節PI3K/AKT信號通路相關蛋白的活性發揮抗腫瘤作用。

圖9 光甘草定作用PC-3細胞后PI3K、AKT、p-PI3K、p- AKT表達的變化。Fig.9 Changes in protein expression levels of PI3K,AKT,p-PI3K,p- AKT in PC-3 cells after treated with glabridin注：與空白組相比，*P<0.05。Note:Compared with blank group,*P<0.05.

3 討論與結論

近年來，中醫藥治療前列腺癌，特別是在CRPC上取得顯著的進展，中醫藥結合手術或者化學治療具有縮小瘤體、降低PSA、減少復發、延長其生存時間等效果[12-14]。不少研究報道提示甘草中的活性成分對CRPC的抑瘤作用顯著，Gioti等[15]研究發現光果甘草提取物(GGE)單獨或與阿霉素聯合使用對雄激素非依賴性前列腺癌細胞(PC-3細胞)均具有抗增殖作用，并能夠促進自噬相關基因如LC3A、ULK1和AMBRA1的表達增強。Zhang等[16]研究發現異甘草素可抑制前列腺癌細胞(PC-3和22RV1)增殖，誘導細胞凋亡，阻滯G2/M細胞周期，并通過體內動物實驗發現其可抑制PC-3異種移植瘤的生長。甘草表現出良好的抗CRPC活性，而甘草中的光甘草定是眾多的黃酮類化合物中備受關注之一，具有良好的抗腫瘤活性，對于CRPC的作用機制值得我們去進一步挖掘。

與傳統藥理學相比，網絡藥理學為新藥研發提供了全新的視角，為了更好地了解光甘草定對CRPC的作用機制，我們運用網絡藥理學的方法，通過TCMIO數據庫、TCMSP數據庫、PharmMapper數據庫等數據庫共收集到683個光甘草定作用靶點，通過韋恩圖工具獲得55個光甘草定作用于去勢抵抗性前列腺癌的關鍵靶點，通過PPI蛋白互作網絡分析得到AKT1、TP53、ESR1、EGFR、ALB等10個核心靶點。GO富集分析顯示光甘草定主要通過調節蛋白磷酸化、氧化反應以及細胞周期等方面調控細胞代謝和細胞凋亡。分子對接進一步顯示，光甘草定與10個核心靶點具有較好的對接活性，預測光甘草定可能通過調控這些核心靶點蛋白的表達，進而達到抗腫瘤作用。在這些核心靶點中，AKT1蛋白的對接活性最高。AKT1是PI3K/AKT信號通路中重要調控因子之一，參與腫瘤的多種生物學過程。在前列腺癌中，基于基因組和轉錄組譜發現，有多達42%的原發性前列腺癌和100%的轉移性前列腺癌樣本檢測出PI3K/AKT通路成分的遺傳變異和基因表達失調[17]。在早期有研究中提出，AKT亞型(AKT1、AKT2)可能促進前列腺癌從雄激素敏感階段轉變為激素難治階段[18]。在CRPC患者治療的基礎研究中，有研究報道，在AKT1/2敲除的去勢抵抗性前列腺癌動物模型中發現，腫瘤在體內和體外轉移灶明顯減少[19]。可見，抑制AKT1的表達，有可能可改善CRPC患者的生存預后，應用AKT1抑制劑可能是CRPC患者一種有潛力的治療方法。我們的研究在理論上提出光甘草定可能是一種AKT1抑制劑，但光甘草定能否成為有效的AKT1抑制劑應用于CRPC患者還有待今后進一步實驗論證。

KEGG通路富集結果顯示，PI3K/AKT信號通路、蛋白聚糖在癌癥、前列腺癌,化學致癌-受體激活、內分泌抵抗、表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑抵抗等105個相關信號通路(P<0.01)。其中，最令人關注的是磷脂酰肌3-激酶(PI3K)/絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶(AKT)信號通路。PI3K/AKT信號通路參與調控細胞代謝、生長、增殖、分化以及蛋白質合成等方面，在人類許多腫瘤中均檢測到PI3K/AKT信號通路的突變。研究數據表明，有高達70%～100%的晚期前列腺癌患者會發生PI3K通路的調控失調[20]。并且發現，在激素敏感性前列腺癌向去勢抵抗性前列腺癌進展過程中，PI3K/AKT信號通路扮演著重要角色，其作用機制可能與雄激素受體(AR)信號通路相關調節有關，該信號通路成分可作為CRPC潛在的生物標志物[21]。目前，PI3K/AKT信號通路相關的抑制劑比如AZD5363等已進入臨床試驗階段，并且取得可觀的療效[22]。研究該通路相關的抑制劑對CRPC的治療具有重大價值。

我們進一步通過CCK8法發現光甘草定可明顯抑制PC-3細胞的增殖，流式細胞術和DAPI染色實驗發現其可誘導細胞凋亡，鏡下觀察到細胞數量減少、形態皺縮。對于抗腫瘤的藥物濃度的篩選，我們發現其IC50稍高，考慮與分子對接采取的是半柔性對接方式有關，相比柔性對接，半柔性對接計算的結合能偏低[23]。再者光甘草定作為天然抗氧化劑，其具有較強的抗氧化作用，但低劑量的天然抗氧化劑在抗腫瘤實驗中未表現出較好的抗腫瘤活性，而高劑量對細胞產生毒性作用，其具體機制有待進一步探索[24,25]。結合網絡藥理學預測的KEGG信號通路結果，我們預測光甘草定對PC-3細胞的抑制作用可能主要與PI3K/AKT信號通路有關，進一步通過Western Blot實驗研究光甘草定對PC-3細胞PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達的影響，結果發現光甘草定可明顯抑制AKT蛋白的磷酸化過程。在我們的實驗中觀察到光甘草定能顯著抑制磷酸化的AKT蛋白的表達，但是對磷酸化的PI3K蛋白表達抑制作用沒有預期效果，經反復調整蛋白上樣濃度和比例，嚴格規范操作后，該蛋白仍未明顯顯影，考慮原因可能與p-PI3K蛋白本身質量問題，效價不高有關。但是由于本次研究經費有限，未再更換其他產品的蛋白，在今后的實驗中，我們將對該通路更多的相關蛋白進行分析，以驗證我們的設想。

綜上，本研究通過網絡藥理學分析并預測光甘草定對去勢抵抗性前列腺癌的潛在作用機制，并通過分子對接以及體外細胞實驗進一步分析驗證，結果表明光甘草定可抑制PC-3細胞增殖、誘導凋亡，其機制與AKT蛋白磷酸化過程有關，故我們推測，其發揮抗CRPC的作用機制可能主要通過調控PI3K/AKT信號通路相關蛋白的磷酸化。本研究不僅為探究光甘草定治療去勢抵抗性前列腺癌的分子機制提供了研究思路，而且為甘草中黃酮類化合物的抗腫瘤藥物研發和臨床應用提供了一種有效方法。