固定化白樺酸親和整體柱的制備方法及其應用

黃小玲，楊鴻雁，單紫軒，袁英才，汪錦才，賴 亮，劉 正，郭嘉亮,*

1 暨南大學藥學院，廣州 510632；2 佛山科學技術學院，佛山 528000

23-羥基白樺酸(23-hydroxyl betulinic acid，23-HBA)是從傳統中藥毛茛科植物白頭翁(Pulsatillachinensis)中分離得到的羽扇豆烷型五環三萜類化合物，同時在多種植物如白樺樹(Betulapubescens)、滇刺棗(Ziziphusmauritiana)、夏枯草(Prunellavulgaris)、夾竹桃(Apocynaceae)等之中均有分布，尤其是樺木科植物中含量最豐富[1]。現代藥理學研究表明其具有抗病毒、腫瘤細胞增殖抑制、抑制血管生成、聯合增敏等一系列作用[2]。譬如，該類化合物作用機理獨特、毒性極低、不良反應較小，是一類極具前途的抗HIV-1的候選化合物；又如，很多23-HBA類衍生物還可以通過抑制細胞生存和生長所需的特定酶(如鳥氨酸脫羧酶等)，從而抑制多種腫瘤和癌細胞的生物活性，如直腸癌、肺癌、白血病、淋巴癌、前列腺癌、卵巢癌等[3,4]。因此，23-HBA被視為具有重要研究價值的先導化合物(leading compound)。

近年來，本課題組對衍生化23-HBA開展了系統研究，獲得活性效果較佳的23-HBA的重要衍生物3,23-二乙酰基-17-乙酸白樺酸(下簡稱Derived-BA)。然而，目前此類23-HBA衍生物作用機制的研究還處于起步階段，其靶標的有關研究尚鮮見報道，面臨靶點不清、機理不明的困局。因此，開發一種有效、快捷、簡便的方法，識別與鑒定天然產物的作用蛋白/酶靶點具有十分廣泛和重要的應用前景。值得關注的是，近年有關藥物靶蛋白的發現與研究具有多種技術手段；其中，基于親和富集垂釣法(affinity enrichment fishing)的化學蛋白質組學技術能夠利用或模擬生物分子之間的專一性作用，作為層析用固定相從復雜混合物中選擇性分析和純化特定物質，從而成為了當下研究小分子藥物蛋白靶點的主要手段之一，具有高通量、低成本等的顯著優勢。迄今為止，親和色譜法已成功應用于他克莫司[5]、環孢菌素[6]、甲氨喋呤[7]等多種藥物靶蛋白的搜尋。通過制備鍵合23-HBA衍生物的新型親和色譜柱，考察對從細胞或組織中提取出來的蛋白進行親和篩選，從而發掘相應的靶點蛋白，有望為尋找和研究天然產物的靶點蛋白建立新思路與方法；同時，也為研究小分子天然產物與不同靶標的作用，提供了重要的研究平臺。

在常見的親和富集基質材料中，硅膠具有良好的色譜性能，但耐酸堿性差；樹脂和瓊脂糖適用的pH范圍較寬，但機械強度差。整體柱(monolithic column)是由單體、交聯劑、引發劑、致孔劑的混合物在色譜柱內通過原位聚合而成的連續床固定相，適合快速分析和流速梯度模式。與傳統的填充柱相比，具有制備方法簡單、易于改性、柱效高、滲透性好、反壓低、傳質速度快等優點；同時還具有可控制孔徑的優點，在生物大分子的分離分析上具有很大的優勢[8]。因此，發展基于耐酸堿性和生物兼容性好的新型聚合物整體材料親和色譜，具有重要理論與實際意義。

有關鍵合23-HBA類化合物的有機聚合物整體柱，目前尚未見文獻報道。本研究主要采用前文報道的“一鍋法”[9,10]，通過原位熱聚合的方式，在100 μm I.D.(內徑)的毛細管柱內制備了新型固定化23-HBA的目標聚合物整體柱poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)；同時深入摸索制備該整體柱的組成和配比，并考察了其作用機理。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

3-(甲基丙基酰氧基)丙基三甲氧基硅烷(3-(triethoxysilyl)propyl methacrylate，γ-MAPS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate，EDMA)、甲基丙烯酸縮水甘油酯(glycidyl-methacrylate，GMA)、鄰苯二甲酸二甲酯購自美國Sigma公司；偶氮二異丁腈(2,2′-azobisisobutyronitrile，AIBN)、乙二胺(ethylenediamine，EDA)、正丙醇(n-propanol，Pro-OH)、1,4-丁二醇(1,4-butanedio，BDO)、甲苯、硫脲均購自阿拉丁化學試劑有限公司；甲醇和乙腈為色譜純，水為三蒸高純水；蛋白、酶等樣品購自上海麗珠東風生化試劑公司或北京百泰生物技術公司；其它一般有機試劑購自廣州化學試劑廠。

EDMA的前處理：將12 mL EDMA加入50 mL的分液漏斗中，然后加入等體積的質量分數5%NaOH溶液，充分震蕩，靜置分層，收取有機層，再加入等體積的質量分數5%NaOH溶液，如此反復堿洗三次；待此操作完成，有機層在用去離子水洗滌至中性；將洗滌后的EDMA用無水MgSO4干燥，置于4 ℃冰箱冷藏干燥24 h；干燥處理之后的EDMA用0.22 μm的有機膜過濾，存于4 ℃冰箱保存，備用。GMA處理方法同EDMA；生孔劑使用前減壓蒸餾；偶氮二異丁腈長期不用需經重結晶處理。其他一般化學試劑未經純化操作。

1.2 主要儀器

DK-S22水浴鍋(上海精宏實驗設備有限公司)；高壓泵(美國Haskel公司)；LX-0.12/10A空氣壓縮機(上海魯辛實業有限公司)；T-50.1L溶劑過濾器(天津津騰實驗設備有限公司)；XL-30E SEM掃描電鏡儀(荷蘭Philips公司)；SPD-15C紫外檢測器(日本Shimadzu公司)；DiNa-S、DiNa-2D 納流泵(日本KYA Technologies公司)；Unimicro TrisepTM色譜工作站(上海通微分析技術有限公司)；20 nL 四通閥(美國Valco公司)；PB-10 pH計(德國Sartorius公司)；石英毛細管375 μm O.D.× 100 μm I.D.(永年銳灃色譜器件有限公司)；KQ2200D超聲儀(東莞科橋超聲波設備有限公司)；0.22 μm濾膜(天津博納艾杰爾科技有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 毛細管的預處理

石英毛細管的活化處理操作如前文所述，具體流程如下(見圖1)：首先用1 M 的NaOH溶液沖洗空的石英毛細管2～3 min，再將石英毛細管兩端封口放在100 ℃的水浴鍋中反應下2 h；準備去離子水沖洗石英毛細管并沖洗至pH=7，用甲醇沖洗石英毛細管30 min后，在高純氮的條件下干燥4 h；按照Vγ-MAPS∶V甲醇=1∶1的比例配制灌入石英毛細管中，1 min后在60 ℃的水浴鍋中反應12 h；最后用甲醇和去離子水各沖洗30 min并在高純氮的環境下干燥12 h至吹干，毛細管預處理完成。

圖1 熔融石英毛細管的預處理流程Fig.1 Pretreatment process of fused silica capillary column

1.3.2 Derived-BA的合成

Derived-BA通過23-HBA化學修飾合成得到。具體過程如下(見圖2)：將23-HBA(0.30 g，0.63 mmol)溶于12 mL干燥吡啶中，加入乙酸酐(1 mL)，室溫攪拌8 h；向反應液中加入25 mL乙酸乙酯，用10%稀鹽酸調pH至4～5，分離有機層，用飽和食鹽水洗滌(50 mL×3)，無水硫酸鈉干燥。過濾、濃縮，用V石油醚∶V乙酸乙酯= 10∶1的洗脫劑，通過硅膠(200～300目)柱層析分離得到白色泡沫狀固體(0.32 g，91.4%)，即為Derived-BA。EI-MS：m/z579.5 [M+Na]+；HR-ESI-MS：m/z579.365 2 [M+Na]+(calcd for 579.366 2，C34H52O6Na)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.77(1H，s，H-29β)，4.61(1H，s，H-29α)，3.83(1H，d，J= 11.6 Hz，H-23β)，3.68(1H，d，J= 11.6 Hz，H-23α)，3.02(1H，m，H-3)，2.06(3H，s，23-OAc)，2.01(3H，s，3-OAc)，1.95(1H，m，H-19)，1.79(1H，m，H-18)，1.69(s，3H，H-30)，0.97(s，3H，H-26)，0.93(s，3H，H-25)，0.88(s，3H，H-24)，0.80(s，2H，H-23)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：40.6(t，C-1)，23.1(t，C-2)，74.5(d，C-3)，40.6(s，C-4)，56.3(d，C-5)，17.9(t，C-6)，36.9(t，C-7)，42.3(s，C-8)，50.5(d，C-9)，38.0(s，C-10)，20.9(t，C-11)，21.1(t，C-12)，38.3(d，C-13)，46.9(s，C-14)，30.6(t，C-15)，32.1(t，C-16)，65.4(s，C-17)，49.2(d，C-18)，48.0(d，C-19)，150.3(s，C-20)，29.6(t，C-21)，34.3(t，C-22)，29.6(q，C-23)，14.5(q，C-24)，16.0(q，C-25)，16.5(q，C-26)，12.8(q，C-27)，181.5(s，C-28)，19.3(q，C-29)，109.7(t，C-30)，171.0(s，C-1′)，22.9(t，C-2′)，170.6(s，C-1′′)，22.6(t，C-2′′)。

圖2 Derived-BA的合成Fig.2 Synthesis of Derived-BA

1.3.3 EDA-BA的合成

3,23-O-二乙酰基-28-白樺酸胺乙基酰胺(EDA-BA)的合成方法如下(見圖3)：100 mL三口圓底燒瓶中分別加入Derived-BA(0.5 g，0.87 mmol)與乙二胺EDA(0.3 mL，5.4 mmol)混合于30 mL二氯甲烷中反應2 h，用V石油醚∶V乙酸乙酯= 4∶1的洗脫劑，通過硅膠柱層析得到白色泡沫狀固體化合物EDA-BA(0.40 g，76.9%)。ESI-MS：m/z599.8 [M+H]+；1H NMR (400 MHz，CDCl3)δ：5.39(1H，s，H-1′)，4.75(1H，s，H-29β)，4.60(1H，s，H-29α)，3.84(1H，d，J= 11.5 Hz，H-23β)，3.68(1H，d，J= 11.5 Hz，H-23α)，3.24(2H，t，H-2′)，3.06(1H，m，H-3)，2.39(1H，m，H-19)，2.06(3H，s，23-OAc)，2.01(3H，s，3-OAc)，1.97(1H，m，H-18)，1.68(3H，s，H-30)，0.97(s，3H，H-26)，0.87(s，3H，H-25)，0.83(s，3H，H-24)，0.74(s，3H，H-23)；13C NMR(100 MHz，CDCl3，TMS)δ：40.5(t，C-1)，23.1(t，C-2)，74.4(d，C-3)，40.5(s，C-4)，55.6(d，C-5)，17.9(t，C-6)，36.9(t，C-7)，40.7(s，C-8)，50.6(d，C-9)，38.0(s，C-10)，20.8(t，C-11)，21.1(t，C-12)，39.3(d，C-13)，42.4(s，C-14)，30.6(t，C-15)，32.10(t，C-16)，65.4(s，C-17)，48.0(d，C-18)，46.8(d，C-19)，150.6(s，C-20)，29.6(t，C-21)，34.3(t，C-22)，29.6(q，C-23)，13.0(q，C-24)，14.5(q，C-25)，16.5(q，C-26)，12.8(q，C-27)，171.0(s，C-28)，19.3(q，C-29)，109.3(t，C-30)，170.9(s，C-1′)，23.5(t，C-2′)，170.6(s，C-1′′)，23.1(t，C-2′′)，39.8(t，C-1′′′)，41.1(t，C-2′′′)。

圖3 EDA-BA的合成Fig.3 Synthesis of EDA-BA

1.3.4 整體柱poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的制備

如圖4所示，準確稱量EDA-BA 9.7 mg、GMA 13.7 mg、Pro-OH 55.0 mg、BDO 45.0 mg，將反應混合液裝入1 mL玻璃瓶中，超聲混合均勻后放在60 ℃中反應1 h后加入EDMA與2.0 mg AIBN，將混合液超聲脫氣后灌入合適長度的預處理好的石英毛細管內，然后兩端用硅膠塞封口，放入水浴60 ℃中反應12 h，有效長度18.0 cm；聚合完成以后用甲醇和水依次沖洗，去除相關未反應物、殘留溶劑或其他可能低聚物。

圖4 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的制備Fig.4 Preparation of poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic column

1.3.5 色譜實驗條件

流動相所用的溶劑均為色譜純，樣品溶劑為乙腈或者流動相；所有流動相使用前均超聲脫氣，并經過0.22 μm 濾膜過濾；檢測波長為214、254以及280 nm。

2 結果與討論

2.1 單體的合成

可聚合的衍生化白樺酸單體的合成如圖3所示：以經過修飾的Derived-BA為原料，首先與乙二胺反應得到28位取代的EDA-BA。乙二胺的引入將形成一定鏈長的間隔臂，通過將乙二胺替換鏈長更長的丁二胺、己二胺均可以達到同樣的效果，從而有望實現對間隔臂長度的控制；另外，由于牽涉含活潑氫化合物反應，反應之前對氨基化試劑乙二胺進行純化也是影響本實驗成敗的關鍵內容之一。

由28位引入間隔臂是基于前期系統的構效關系研究，一般對28位的結構修飾將不會影響白樺酸衍生物的整體活性，這也提示了本研究方法需要基于對天然產物小分子的各個反應位點的構效關系探究。

在聚合過程中，EDA-BA容易與GMA 反應，得到28位取代的3,23-O-二乙酰基-28-甲基丙烯酸縮水甘油酯-白樺酸胺乙基酰胺單體(GMA-EDA-BA)，然后直接與其他單體形成聚合物。此過程無需一一進行單體純化，節省了GMA-EDA-BA單體的純化時間、簡化了反應步驟，凸顯了“一鍋法”的優越性。在此“一鍋法”中，GMA還可被替換成其他含有活潑環氧基團并可發生開環反應的單體化合物，具有進一步拓展的空間。當目標天然產物小分子屬于含活潑氫化合物時(如堿性化合物(如伯胺、仲胺、酰胺等)和酸性化合物(如羧酸、酚、醇等))，即可與環氧單體反應，然后進而與其它單體聚合形成聚合物，間接實現了天然產物小分子固定在相應的整體材料上，得到目標整體柱。可見，這種“一鍋法”具有明確的廣闊的適用范圍和推廣價值。

2.2 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的優化

優化步驟如前文所述，此處研究重點考察了在不同單體配比和不同生孔劑組成的條件下整體柱聚合的情況。EDA-BA能溶于甲醇、丙醇等，先后嘗試了四種生孔劑系統：一元生孔劑MeOH、二元生孔劑MeOH/DMSO、MeOH/H2O、Pro-OH/BDO。結果表明以MeOH為生孔劑時，柱子聚合不均勻，出現脫壁的現象；以二元溶劑系統MeOH/DMSO、MeOH/H2O為生孔劑時，單體沒有鍵合至毛細管內壁，證明三個生孔劑系統均功能性單體不能完全溶解，故得不到致密的聚合物；將生孔劑系統調整為Pro-OH/BDO(1∶1)后，可以保證所有單體的溶解度并最終得到孔道均勻致密的聚合物。考慮到 EDA-BA/GMA之間的作用情況，調節兩者之間的比例，結果表明EDA-BA/GMA的質量比約為5∶7時聚合情況最為理想。進一步優化單體和交聯劑的比例，如表1所示，B3為制備柱的最優條件。

表1 制備 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的配比優化Table 1 Compositions of the polymerization mixtures used for the preparation of poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic columns and their porosities

2.3 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的表征

2.3.1 通透性的測試

通透性(K)是液相色譜柱一個很重要的參數，一般而言，K值可以通過液相色譜的方法，采用乙腈、水、甲醇等作為流動相，依據Bristow and Knox方程測得[11]：

其中u代表流動相的線性速度，η代表流動相的粘度[12]，L代表柱子的色譜柱的有效長度，ΔP代表色譜柱背壓。

如表2所示，在不同的流動相作用下，K值始終在一個數量級上面，這說明整體柱在不同極性強度的流動相體系下沒有明顯發生溶脹或皺縮，表明整體柱的骨架穩定。如表2所示，在不同的流動相作用下，K值始終在一個數量級上面，這說明整體柱在不同極性強度的流動相體系下沒有明顯發生溶脹或皺縮，表明整體柱的骨架穩定[12]。

表2 整體柱 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的通透性Table 2 Permeability of the poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic column

2.3.2 機械強度

采用微徑液相色譜的方法，考察在不同的流動相條件下，線性流速與背壓的關系。本文實驗分別選擇了水、乙腈/水(80∶20，V/V)作為流動相，考察在不同的流速條件下，線性流速與柱壓的關系。實驗結果顯示，線性流速與柱壓具有良好的線性關系(R2>0.99)，表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)具有良好的機械強度(見圖5)。

圖5 線性流速與背壓的關系Fig.5 The relationship between linear flow rate and backpressure

2.3.3 重現性

采用微徑液相色譜的方法，測試標準樣品保留時間或者保留因子的RSD值。反相色譜評價常選用乙腈/水體系，檢測波長為254 nm(在此波長下乙腈等無紫外吸收)。本實驗采用乙腈/水(50∶50，V/V)作為流動相，標準物為硫脲(thiourea)、鄰苯二甲酸二甲酯 (dimethylphthalate)、苯甲醚(anisole)、萘(naphthalene)，如下表3所示，各項保留因子的RSD均小于5%，表明重現性良好。

表3 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的保留重現性Table 3 Reproducibility of the poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic column

此處以硫脲為死時間標記物，四種組分均為中性物質，其中硫脲極性最強，鄰苯二甲酸二甲酯和苯甲醚次之，萘極性最弱，用來衡量色譜柱的柱效，洗脫次序是硫脲、鄰苯二甲酸二甲酯、苯甲醚、萘(見圖6)。

圖6 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱分離四個反相標樣Fig.6 Separation of a test mixture on poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic column.注：分離條件：流動相為乙腈/水(50/50，V/V)；流速為600 nL/min；進樣量為20 nL；檢測波長為214 nm；樣品依此為：1.硫脲；2.鄰苯二甲酸二甲酯；3.苯甲醚；4.萘。Note:Conditions:ACN/H2O (50/50,V/V);Flow rate:600 nL/min;Injection volume,20 nL;Detection wavelength:214 nm.Samples:1.Thiourea;2.Dimethylphthalate;3.Anisole;4.Naphthalene.

2.3.4 元素分析

為了考察poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的實際組成，對其聚合物組成進行了元素分析測試。其中，C、O、H和N的含量分別是72.20%、13.36%、9.76%和4.68%，已知聚合物中N元素僅由EDA-BA分子提供，由此可確認白樺酸成功鍵合到固定相上。由此可見，結果均說明“一鍋法”原位聚合制備的小分子天然產物鍵合的整體柱是可行而且可靠的，并有望應用于其他小分子藥物、化合物及天然產物等制備對應的整體柱。

2.3.5 掃描電鏡

如前所述，整體柱的微觀結構同樣通過掃描電子顯微鏡的方法獲得。圖7所示為表1中B3整體柱橫切面的掃描電鏡圖。整體柱孔狀結構明顯，雖然聚合沒有很緊密，但疏松的結構有助于下一步的應用。

圖7 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的掃描電鏡Fig.7 SEM photographs of poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolith

2.4 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的作用機理

有機聚合物整體柱poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)中的主要功能單體BA是五環三萜類化合物，從其化學結構可以初步推斷該整體柱的主要分離機理，尤其從EDA-BA的化學結構可知，由于其是典型的五環三萜類化合物，同時疏水性乙酰基取代可提供游離氫的親水性羥基，導致其主要表現為反相色譜的保留機制，而其28位上的氨基由于可以提供游離氫，提示可能存在微弱的親水作用機理。

采用微徑液相色譜的方法，測定poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的保留機理。分離條件：柱尺寸為220 mm × 100 μm I.D.；流動相為 ACN/H2O；檢測波長為214 nm；流速為600 nL/min；進樣量為20 nL。以非極性化合物甲苯和極性化合物硫脲為測試化合物，乙腈、水為流動相。通過改變流動相中乙腈的含量，考察甲苯和硫脲的保留時間的變化。如圖8所示，對于強極性的化合物硫脲，在反相 HPLC條件下通常作為死時間標記物，在poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱上，當乙腈的含量從30%增至50%時，硫脲的保留時間基本不變，而甲苯的保留時間顯著降低；當乙腈的百分含量大于50%時，硫脲的保留時間有輕微的增長，甲苯的保留時間則有漸漸減少；兩者的保留時間在乙腈的百分含量為80%～90%處交匯。實驗結果表明poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱主要表現為反相作用機理。

圖8 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱上乙腈含量與保留時間的關系Fig.8 Influence of ACN concentration on retention time on poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic column

2.5 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)整體柱的應用

通過將不同類型常見蛋白與酶注入整體柱中，若形成明顯的色譜保留，則提示整體柱對該類別蛋白的選擇性。分離條件：緩沖液buffer A為Tri/HCl(25 mmol/L，pH 6.5)，緩沖液buffer B為NaCl(50 mmol/L，pH 6.5)；洗脫程序為0～8 min buffer A，8～20 min buffer B，20～25 min buffer A；流速為1 000 nL/min；檢測波長為280 nm。由圖9可見，當流動相為Tri/HCl緩沖鹽(pH 6.5)時，多種蛋白包括胰蛋白酶(trypsin)、牛血清白蛋白(bovine albumin，BSA)、人血清白蛋白(human serum albumin，HSA)以及細胞色素C(cytochrome C)等在整體柱poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) 上未見顯著保留，幾乎都在死時間出峰；當流動相為強鹽NaCl緩沖鹽時，親和作用力被破壞，α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)才開始出峰，在該色譜柱上形成了明顯保留，提示其被整體柱特異性識別。文獻調研發現，BA在治療糖尿病上表現出良好功效，其中主要通過抑制α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶，從而減少多糖的水解和促進糖原合成來實現作用效果[13,14]，由此提示，BA可能與α-葡萄糖苷酶形成親和作用關系，進而獲得明顯的色譜保留效果。本研究為此整體柱的作用機制探索提供了可參考的科學依據，但在實際樣品中的具體應用尚需要在后續工作中進一步推進。

圖9 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) 整體柱對不同蛋白的保留Fig.9 Comparison of interaction of poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA) monolithic column with various proteins

3 結論

本文中對一種固定化天然產物小分子的親和色譜柱制備方法進行探索，首先在基本不影響活性的28位上進行修飾，合成了帶有活潑乙二胺基團的EDA-BA功能性單體(配體)，與其他單體及交聯劑通過“一鍋法”制備 poly(GMA-EDA-BA-co-EDMA)的整體色譜柱。本研究的核心在于開發具有推廣價值的固定化天然產物小分子的親和色譜柱制備方法。“一鍋法”在制備效率上具有很大的優勢，不僅節省時間、減少單體化合物的純化耗費，同時也保持了色譜柱的親和作用力。不過，功能性單體(配體)的商業化程度的高低，決定了方法的進一步推廣價值；就目前而言，還需要根據每一個小分子進行衍生化設計，存在一定的不足。至于該親和色譜柱在復雜體系的實際應用以及推廣，需在后續實驗中進一步進行研究。

天然產物一直是新藥發現的重要來源，將天然產物固定化制備對應的親和色譜柱有助于天然產物的開發，因此成為了研究熱點之一。本文為尋找和研究天然產物的靶點蛋白建立一種快速、有效、可行的方法；同時，也為探索小分子天然產物與不同靶標的作用，提供了重要的研究方法和研究平臺，有望得到進一步的應用與推廣。