基于不同提取方法的漢麻莖葉精油全組分鑒定及比較研究

李智寧，李飛飛，宋夢嬌，馬艷妮，張麗先，張桃桃，魏 悅*

1河南省科學院天然產物創新研究中心；2河南省納普生物技術有限公司；3河南省植物天然產物開發工程技術研究中心，鄭州 450000；4河南中醫藥大學藥學院，鄭州 450046

漢麻，又名工業大麻(CannabissativaL.)，為大麻科(Cannabaceae)大麻屬(CannabisL.)一年生草本植物，又名火麻、云麻等，是指植物中四氫大麻酚(tetrahydrocannabinol，THC)含量低于0.3%的非毒品性大麻類型[1,2]。大麻是我國的傳統經濟作物也是歷史悠久的藥用植物[3]，其種子(火麻仁)、莖稈以及花葉具有不同的實際應用價值[4]。最新基于基因組重測序的研究顯示，大麻最早起源于東亞，之后按照纖維型大麻(工業大麻)和毒品型大麻兩種模式經過強烈的人工馴化形成了現今形態各異的大麻品種[5]。我國有20多個省市都有工業大麻種植歷史，其中大面積種植工業大麻的地區有黑龍江和云南省，甘肅、吉林等地也有零星種植[6]，其應用涉及醫藥、食品、保健品和化妝品等多個領域[7]。現代藥理研究表明，大麻具有鎮痛、降眼壓、抗腫瘤、抗嘔吐、抗紫外、抗菌、抗炎等功能活性[8,9]。近年來，大麻非精神活性類成分大麻二酚(cannabidiol，CBD)的作用機制和新藥研發取得了突破性進展，基于CBD的各種大麻新產品開發成為了國際熱點，而我國在該領域的研究幾乎空白[10]。此外，大麻精油作為大麻植株體內一種揮發性成分也含有較強的活性因子。例如，石竹烯可用于治療慢性支氣管炎和關節炎、α-蒎烯可用于治療黑色素瘤，亞油酸乙酯可用于降低血脂改善動脈粥樣硬化，紅沒藥醇可以用于保護、治療皮膚過敏等[11]。國外已有研究應用于日化領域，形成了護手霜，浴液，面霜等產品，由于其政策敏感性，國內相關開發和利用研究很少。

植物精油提取方法主要有固相微萃取法[12]、同時蒸餾萃取法[13]、微波輔助萃取法[14]、超臨界流體萃取法和亞臨界流體萃取法等[15-21]，如Tian等[22]采用微波輔助-水蒸氣蒸餾法和超臨界CO2萃取法提取漢麻葉精油，共鑒定出90種化合物，多為烴類、醇類等小分子揮發物，且其采用頂空萃取進樣，操作繁瑣，易造成重現性差等問題，鑒定出的種類也不齊全，不能全面反映精油全組分。因此，本研究分別采用水蒸餾提取法(以下簡稱水蒸餾法)、亞臨界以及超臨界萃取法三種方法來獲得漢麻莖葉精油，系統全面地比較三種方法獲得的精油全組分及其各組分間含量的差異性和特征性，以期發現更多潛在活性成分為漢麻產業合理、合規的開發利用提供科學依據，也為后期進行漢麻精油的活性測試和批量提取選擇一個高效便捷的提取方式，為漢麻精油(組分)產品開發及其抗氧化、抗炎等活性篩選提供研究基礎，具有理論和指導意義。

1 材料與方法

1.1 原料

挑選完整、無蟲病害的漢麻植株(云南昆明)作為試驗原料，漢麻莖葉原料從產地直接收集，經河南省科學院趙天增研究員鑒定，均為大麻科Cannabaceae大麻屬CannabisLinn.漢麻CannabissalivaL.植株的莖葉，標本存放于河南省科學院天然產物重點實驗室(編號zwyn20180017)。

1.2 儀器與試劑

GCMS-2010Uira 型氣相色譜-質譜儀(日本島津公司)；超臨界萃取裝置、亞臨界萃取裝置、LPG-5型噴霧干燥器(常州市一新機械廠)；HSCE40-24X2型大提取裝置(上海研究機械設備有限公司)；KQ-5WE超聲池(昆山市超聲儀器有限公司)；ME204型萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；甲醇(LC/MS級，Fisher Scientific公司)；水為娃哈哈礦泉水，乙醇等其他試劑均為分析純。

1.3 色譜條件

色譜柱：Rxi-5ms(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；柱流量：1.16 mL/min；流量控制方式：線速度；壓力：78.1 kPa；進樣量：1 μL；進樣口溫度：280 ℃；柱溫80 ℃(保持1 min)，以5 ℃/min升到220 ℃(保持2 min)，5 ℃/min升到320 ℃(保持5 min)，分流比50∶1。

1.4 質譜條件

離子源EI，Scan掃描模式；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；電子能力70 eV；檢測器電壓0.93 kV；溶劑延遲3.0 min。掃描范圍35～500 amu；經GC-MS分析得到不同提取方式下漢麻精油的總離子流色譜圖(total ion chromatogram，TIC)(見圖1～3)。

圖1 水蒸餾方法提取漢麻精油的總離子流色譜圖Fig.1 TIC of hemp essential oil extracted by water distillation method

圖2 亞臨界方法提取漢麻精油的總離子流色譜圖Fig.2 TIC of hemp essential oil extracted by subcritical method

圖3 超臨界方法提取漢麻精油的總離子流色譜圖Fig.3 TIC of hemp essential oil extracted by supercritical method

1.5 樣本前處理

將漢麻莖葉原料置于干燥陰涼的地方陰干，使用粉碎機粉碎并通過二號篩(24目)，得到漢麻莖葉粗粉，將過篩的樣品放于密封袋中，放置在4 ℃的冰箱中備用。

1.5.1 水蒸餾法

稱取處理好的漢麻莖葉粗粉約75.00 g(準確至0.01 g)，將粗粉置于1 000 mL圓底燒瓶中，再按照料液比1∶10將水加入到圓底燒瓶中，混合攪拌均勻，在50 ℃下平衡0.5 h，50 ℃溫浴2 h，采用水蒸氣蒸餾法收集餾出的揮發油，根據《中國藥典》2020版四部通則附錄揮發油測定法(2204)進行提取[24]，保持微沸大約3～5 h左右，當精油提取器中的精油量不再增加時停止加熱，放置片刻，讀取漢麻精油的提取含量并分離出精油，重復提取3次，計算物料中漢麻精油的收率平均值。

漢麻莖葉精油得率 (mL/g)=

漢麻莖葉精油體積 (mL)/漢麻莖葉粗粉質量 (g)

1.5.2 亞臨界法

稱取約50.00 g(準確至0.01 g)漢麻莖葉粗粉放置于亞臨界萃取裝置中，使用丁烷為夾帶劑，萃取溫度40 ℃，萃取壓強為0.45 MPa，萃取時間為20 min，萃取3次。萃取液從萃取罐進入分離罐，減壓脫除溶劑，得到粗提物，在攪拌下向浸膏中加入10 倍量的95%乙醇，加熱至50 ℃，保持40 min使其充分溶解，待溶液冷卻至室溫后，轉移至-20 ℃冰箱中冷凍過夜，抽濾后，在0.01 MPa、浴溫35 ℃條件下將濾液濃縮至無溶劑，得到漢麻莖葉精油樣品，并計算供試品中精油的收率[15,16]。精油得率計算公式同“1.5.1”。

1.5.3 超臨界法

稱取約50.00 g(準確至0.01 g)的漢麻莖葉粗粉添加到萃取釜，密封安裝后進行超臨界CO2萃取，萃取壓力為29 MPa，萃取溫度49 ℃，萃取時間4 h，CO2流量為13 mL/min，最后記錄所提取得到的精油含量，并計算供試品中漢麻莖葉精油的收率[25]。精油得率計算公式同“1.5.1”。

1.5.4 供試品溶液的制備

準確稱取上述方法制備獲得的精油約100 mg放于10 mL的離心管中，加入5 mL甲醇(或正己烷)超聲提取溶解，并定容，再將配置好的溶液稀釋50倍，用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得。

2 結果與討論

2.1 三種方法制備漢麻莖葉精油的比較

采用3種方法制備得到的漢麻莖葉精油的得率、性狀及鑒定化合物數如表1所示。結果表明，三種方法提取的漢麻莖葉精油得率差異明顯。亞臨界法和超臨界法比水蒸餾法的得率提高了50%以上，得到的精油顏色稍深；超臨界萃取法提取的精油得率最高，采用乙醇作夾帶劑，溶解出漢麻莖葉中的色素成分，因此精油顏色較深，顯現出綠黃色油狀，濃縮除去精油中的乙醇，最終精油得率為0.0031 mL/g。從鑒定化合物數進行比較，水蒸餾法提取得到的成分最多，高達89個，而亞臨界和超臨界兩種方法獲得的成分比較接近，且有高達40個共有成分，所得指紋圖譜也很相近。

表1 三種方法制備的漢麻莖葉精油的比較Table 1 Comparison of essential oils from stems and leaves of hemp prepared by three methods

2.2 漢麻精油成分GC-MS分析

將所得的精油全組分的質譜圖與分析軟件中的美國國家科學技術研究所的NIST質譜庫2011版和2014版(NIST-2011、NIST-2014)進行檢索比對并結合文獻查閱分析，對各個成分峰的化合物的相似度進行評價分析，采用峰面積歸一化法計算出各組分的相對含量，結果見表2。結果表明，水蒸餾法共提取出89種成分，亞臨界萃取法共提取出62種成分，超臨界萃取法共提取出59種成分，三者共計含有13種共有成分。水蒸餾法所提取得到的成分最多，且主成分在種類和含量上也有較大差異。其中，水蒸餾法提取的成分中主要有：大麻二酚(19.69%)、α-紅沒藥醇(9.07%)、石竹烯及其衍生物(8.87%)、植物醇(8.54%)、次大麻二酚(7.05%)、抗氧劑168(4.01%)、Δ9-四氫大麻酚(4.00%)、大麻酚(3.04%)、大根香葉酮(2.80%)、大麻色原烯(2.78%)、大麻環酚(2.51%)、大根香葉三烯醇(2.41%)、鄰苯二甲酸二丁酯(2.02%)、β-愈創木烯(1.78%)、植酮(1.51%)等成分，同時還含有大量的低揮發性小分子化合物；亞臨界法提取的成分主要有：鄰苯二甲酸二正辛酯(17.56%)、亞油酸甲酯(8.66%)、二十二烷基多沙酸8,11,14-三烯酸酯(7.94%)、大麻二酚(7.86%)、亞油酸(6.51%)、(Z)-9-十六碳烯醛(6.41%)、Δ9-四氫大麻酚(5.90%)、γ-谷甾醇(5.24%)、棕櫚酸(3.61%)、甘油(3.51%)、(+)-檸檬烯(2.35%)、植物醇(2.42%)、棕櫚酸甲酯(1.86%)、大麻色原烯(1.79%)、大麻酚(1.84%)等成分；超臨界法提取的成分主要有：油酸(22.50%)、大麻二酚(8.71%)、亞油酸(7.68%)、γ-谷甾醇(6.71%)、Δ9-四氫大麻酚(6.62%)、(+)-檸檬烯(4.17%)、棕櫚酸(4.05%)、油酸乙酯(2.92%)、鄰苯二甲酸二正辛酯(2.89%)、大麻酚(2.09%)、大麻色原烯(1.80%)、亞油酸甲酯(1.40%)、膽固醇(1.38%)、亞油酸縮水甘油酯(1.36%)、棕櫚酸甲酯(1.34%)、甘油(1.32%)、Δ9-四氫大麻素(1.16%)等成分。

表2 不同提取方法下漢麻精油成分鑒定和比較分析Table 2 Component identification and comparative analysis of hemp essential oil under three different extraction methods

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

續表2(Continued Tab.2)

亞臨界萃取法和超臨界萃取法所得到的成分在種類上有著很大的相似性，且多為半揮發性成分或大分子化合物，經統計發現二者共有40個共有成分。其中甘油，棕櫚酸甲酯，棕櫚酸，亞油酸，Δ9-四氫大麻素，大麻二酚、大麻色原烯，大麻酚、Δ9-四氫大麻酚、γ-谷甾醇、坎培甾醇等在含量上比較接近。然而，亞臨界法所獲得的(+)-檸檬烯、油酸乙酯、油酸縮水甘油酯、棕櫚油酸等成分含量低至超臨界法的2-5倍左右，但卻遠高于水蒸餾法所得，而亞油酸甲酯成分含量遠高于超臨界法和水蒸餾法。同樣，水蒸餾法所得的α-紅沒藥醇，植物醇，植酮，次大麻二酚，大麻二酚等明顯高于亞臨界法和超臨界法。此外，亞臨界法獲得了較高含量的鄰苯二甲酸二正辛酯和二十二烷基多沙酸8,11,14-三烯酸酯兩種酯類成分，占比高達25.5%，而超臨界法獲得了較高含量的油酸，占比22.5%，同時，二者提取獲得的高分子化合物或半揮發性成分明顯多于水蒸餾法所得，但小分子化合物或低沸點的成分卻損失嚴重。這可能是基質所處的提取環境，提取條件，夾帶劑的使用不同等原因使得所提取的精油成分與溶劑分子間作用力不同而造成。

3 討論與結論

本試驗經過大量試驗優化和篩選，獲得3種方法下漢麻精油的GC-MS總離子流色譜圖，使得各成分間實現較好的分離，提高了鑒定的準確度、可信度。通過對3種不同提取方法所獲得的漢麻精油全組分進行GC-MS鑒定分析和比較研究，結果發現：三種方法所得精油共計鑒定出154個成分，且含有13個共有成分，相似度均在80%以上，其中水蒸餾法獲得提取成分最多，高達89種，多為烷烴、烯烴、醇類、醛類、倍半萜類等小分子化合物成分，而超臨界和亞臨界萃取法所得精油組分在具有一定的相似性，多為酸類，醇類，酯類，酚類等高沸點化合物或大分子化合物，且含有40個共有峰，但含量差異明顯，如植物醇，亞油酸，油酸，大麻二酚等。

雖然水蒸餾法獲得的提取成分種類比較多，但是出油率較低，并且揮發性成分或主成分含量也與另外兩種提取方法有著較大的差異。這是因為水蒸氣蒸餾時，熱水中能溶解一定比例的精油(揮發油)成分，水蒸氣蒸餾時蒸餾溫度能達到100 ℃，所以，沸點較高的成分不容易被蒸出，同時，不同成分在熱水中溶解度不同，各成分被蒸出的比例也不盡相同。水蒸餾法主要將那些低沸點、小分子化合物成分等提取出來，因此，使用水蒸餾法可以獲得較多種類的揮發性成分。而亞臨界和超臨界兩種提取方法在提取原理和獲得成分上具有一定的相似性，二者提取時在適宜的臨界溫度和壓強下可使得極性較大的化合物，高沸點化合物或大分子化合物分離出來，同時伴隨著夾帶劑的使用，夾帶劑與溶質分子間存在范德華力或夾帶劑與溶質具有特定的分子間作用，如氫鍵及其他各種作用力，這樣不僅改善和維持了萃取的選擇性，而且還提高了難揮發性溶質和極性溶質的溶解度，相比水蒸餾法可以分離萃取出更多中性成分或半揮發性成分，同時也會造成一些小分子成分的損失。綜合考慮，亞臨界萃取法作為一種新型萃取手段，具有低溫高保活、常壓易實現、環境友好型優點，最大限度地保留了熱敏性，易揮發性，易水解，易氧化組分，同時還具有節能、成本低等優點，可考慮將亞臨界萃取法作為提取漢麻精油的理想方法。

漢麻精油是漢麻植株體內的一種揮發性次生代謝產物，其中的一些組分具有獨特的藥用和食用價值，鑒于其本身具有較強的揮發性，滲透性，芳香性，不僅可以調節情緒，還可以抗蟲，抗菌等，具有較高的應用前景。因此，本試驗可為后期進行漢麻精油的活性測試和批量提取選擇一種高效便捷的提取方式提供試驗依據，為進一步定性定量研究漢麻精油(組分)及其功能活性價值提供數據和參考，也為深入挖掘漢麻應用潛力以增強漢麻產業發展后進提供科學指導。