牡丹根不同部位成分差異性分析

張樹蓉，趙宏蘇,2，歐迎雪，翟宏焱，吳德玲,2,4,5，張 村，張 偉,2,4,5*

1安徽中醫藥大學藥學院；2中藥飲片制造新技術安徽省重點實驗室，合肥 230012；3安徽省食品藥品檢驗研究院，合肥 230051；4國家藥品監督管理局中藥質量研究與評價重點實驗室；5安徽中醫藥大學國家中醫藥管理局中藥炮制傳承基地，合肥 230012；6中國中醫科學院中藥研究所，北京 100700

毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.的藥用部位多為其根皮(牡丹皮)，臨床應用廣泛，具有清熱涼血、活血化瘀功效[1]。現代研究表明，牡丹中主要化學成分為酚及酚苷類成分代表丹皮酚、單萜及其苷類成分代表芍藥苷、鞣酸類成分代表沒食子酸等，其主要藥理作用有抗炎、抗菌、中樞抑制、調節免疫、調節心血管系統等[2-8]。早在南北朝《雷公炮制論》中就記載“凡采牡丹皮根，日干，以銅刀劈破去骨。”[9]，《本草經集注》：“色赤者為好，用之去心”[10]中也記載牡丹皮去心加工方法并沿用至今。自宋代《傳信適用方》[11]中記載牡丹皮“去心及粗皮”、《萬病回春》[12]中記載“去皮”開始，說明臨床應用中出現刮去栓皮的牡丹皮，即現今應用的“粉丹皮”。在《中華人民共和國藥典》(2020版一部)中，收載牡丹皮為連丹皮和刮丹皮兩種規格，且挑選長5～20 cm，直徑在0.5～1.2 cm范圍內的根皮入藥，導致牡丹的側根、須根以及木心、栓皮等部位作為不合格或非藥用部位舍棄，造成極大的資源浪費。在產地及市場調研中發現，牡丹皮道地產區加工中只抽心不去栓皮，市場上的刮丹皮多數以外觀潔凈為其商業目的。因此對牡丹根其他部位的有效成分進行研究，可一定程度上擴大牡丹根部利用率，減少資源浪費。

前期研究發現在牡丹不同部位均分布有藥效成分[13-18]，本研究根據加工過程將藥用牡丹根分為連丹皮、刮丹皮、栓皮、木心、須根五個部位進行特征圖譜研究并結合化學計量學分析不同化學組分在牡丹根加工過程中分成的不同部位中的分布，對其進行質量的整體性及專屬性評價，為牡丹皮規格等級劃分提供科學依據，非藥用部位的開發利用奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters ACQUITY H-CLASS UPLC超高效液相色譜儀(組成：四元溶劑管理器、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器、Empower 2工作站、真空脫氣機等)；PALL Cascada II.I實驗室純水一體化系統(PALL過濾器北京有限公司)；EX125DZHW十萬分之一天平(奧豪斯儀器(上海)有限公司)；WL-100型打粉機(浙江省威力制藥機械廠)；KQ700DE型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料

氧化芍藥苷(批號：16021505，純度≥98%)、丹皮酚新苷(批號：100291-86-9，純度≥98%)、芍藥苷 (批號：0736-200015，純度≥98%，以上購于北京世紀奧科生物技術有限公司)、沒食子酸(批號：GZDD-0128，純度≥98%，購于貴州迪大生物科技有限責任公司)、沒食子酸甲酯(批號：DST200424-077，純度≥98%)、丹皮酚原苷(批號：DST200302-049，純度≥98%)、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖(批號：DST200518-001，純度≥98%)、牡丹皮苷C(批號：DST200226-065，純度≥98%)、苯甲酰氧化芍藥苷(批號：DST191210-088，純度≥95%)、苯甲酰芍藥苷 (批號：20032703，純度≥98%，以上購于成都普菲德生物技術有限公司)、芍藥內酯苷(批號：39011-90-0，純度≥98%，購于上海源葉生物科技有限公司)、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖(批號：CFS201901，純度≥98%，購于武漢天植生物技術有限公司)；丹皮酚(由天然藥物化學實驗室自制，純度大于99%)。

乙腈、甲醇(色譜級，美國Fisher公司)；甲酸(色譜級，美國Sigma公司)，其他試劑均為分析級。

1.3 樣品來源與分類

牡丹植株采自安徽省蕪湖市、銅陵市、亳州市，經安徽中醫藥大學方成武教授鑒定原植物為毛茛科植物牡丹PaeoniasuffruticosaAndr.。10月份采挖根部，除去地上部分和根部表面泥沙。將牡丹根按照加工過程進行分類。

抽取牡丹根部木心作為木心部位；剝取的根皮作為連丹皮部位；將連丹皮表面栓皮刮去，分別得到栓皮部位和刮丹皮部位(韌皮部)；參照《中國藥典》2020版一部中，直徑小于0.5 cm細根即為須根；收集栓皮、木心、須根、連丹皮、刮丹皮五個部位，分別曬干，備用。牡丹根不同部位取材見圖1，樣品具體產地信息見表1。

圖1 牡丹根各部位示意圖Fig.1 Schematic diagram of peony root

表1 樣品信息來源Table 1 Sources of samples

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

稱取沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚對照品適量，精密稱定。加70%甲醇溶解制成質量濃度分別為88.2、147、55.5、169.5、212.4、60.6、282.5、71.428、179.1、59.2、54.8、119.6、364.5 μg/mL的對照品儲備液，4 ℃保存備用。

2.2 供試品溶液制備

稱取表1中藥材栓皮、木心、須根、連丹皮、刮丹皮粉末(過4號篩)，每份0.25 g，精密稱定，置具塞錐形瓶，精密加入70%的甲醇25 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min(功率280 W，頻率40 kHz)，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補重，搖勻，離心(4 500 r/min，10 min)，取上清液用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱為Thermo Scientific Syncronis C18(2.1 mm × 100 mm，1.7 μm)，流動相為乙腈(A)和0.1%甲酸水溶液(B)，柱溫：30 ℃，進樣體積：2 μL，流速：0.2 mL/min，檢測波長：246 nm 。梯度洗脫程序為0～1 min，8%→15%A；1～5 min，15%A；5～8 min，15%→18%A；8～15 min，18%→30%A；15～20 min，30%→45%A；20～24 min，45%→95%A；24～24.5 min，95%→8%A；24.5～30 min，8%A。

2.4 方法學考察

2.4.1 精密度試驗

精密稱取MC-5號粉末，按“2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”項色譜條件重復進樣6次，測得沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚RSD值均在0.48%～2.35%。結果表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩定性試驗

精密稱取MC-5號粉末，按“2.2”項下制備供試品溶液，分別在制備后0、4、8、12、16、20 h按“2.1”項色譜條件進行色譜分析。測得沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚的RSD值均在1.32%～2.73%，表明樣品溶液在20 h內相對穩定。

2.4.3 重復性試驗

精密稱取MC-5號粉末6份，按“2.2”項下制備供試液，按“2.1”項色譜條件依次進樣，測得沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚含量的RSD均在1.63%～2.90%。表明該方法重復性良好。

2.4.4 加樣回收率

精密稱取已知含量的樣品粉末(MC-5)6份，每份約0.125 g，另取沒食子酸等對照品，用70%甲醇制成一定濃度混合對照品溶液。按“2.2”項下制備供試液，按“2.1”項色譜條件依次進樣，測得沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚的回收率為98.73%～101.66%，其RSD均在0.62%～2.89%，表明方法準確度良好。

2.4.5 線性關系考察

精密適量移取各對照品儲備液于5 mL容量瓶中，70%甲醇定容至刻度，混勻，即得混合對照品儲備液，按2、5、10、20、50、100倍稀釋，得系列混合對照品溶液。以峰面積(y)為縱坐標，濃度為橫坐標(x)繪制標準曲線，進行線性回歸，回歸方程、相關系數及線性范圍見表2。結果表明，各對照品在各自濃度范圍內的線性關系良好。

表2 13種對照品的線性回歸方程Table 2 Linear regression equation of 13 reference substance of Cortex Moutan

2.5 牡丹根不同部位差異性標志成分挖掘

2.5.1 UPLC特征圖譜的建立及共有峰標定

將各批次牡丹皮樣品UPLC圖譜數據導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012A版)”，設定(MC-1)為參照圖譜，采用中位數法，時間窗的寬度默認為0.1 min，經過多點校正后將譜峰自動匹配，生成30批牡丹根不同部位UPLC特征圖譜(見圖2)和對照圖譜(見圖3)，共標定共有峰19個，通過對照品色譜圖指認，確定1號峰為沒食子酸，2號峰為氧化芍藥苷，4號峰為沒食子酸甲酯，5號峰為丹皮酚原苷，7號峰為丹皮酚新苷，8號峰為芍藥內酯苷，10號峰為芍藥苷，13號峰為1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖，14號峰為1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖，15號峰為牡丹皮苷C，16號峰為苯甲酰氧化芍藥苷，17號峰為苯甲酰芍藥苷，19號峰為丹皮酚。

圖2 牡丹根不同部位特征圖譜Fig.2 Characteristic map of different parts of peony root

圖3 牡丹根不同部位對照圖譜Fig.3 Control map of different parts of peony root

2.5.2 聚類分析(HCA)

以30批牡丹根不同部位樣品UPLC特征圖譜共有峰面積為變量，運用IBM SPSS Statistics 26.0以平方歐氏距離(Euclidean距離)為區間，采用組間聯接法對30批牡丹根不同部位樣品進行聚類分析，結果見圖4。當分類距離達到15時，可分為3類，其中須根、連丹皮、刮丹皮基本聚為一類，栓皮聚為一類，木心基本聚為一類，說明連丹皮、刮丹皮、須根化學成分及含量無顯著性差異，木心和栓皮與連丹皮、刮丹皮等常規藥用部位的共有成分含量差異顯著，聚類分析可以將牡丹根傳統藥用部位和非藥用部位分開。

圖4 牡丹根不同部位樣品聚類分析結果Fig.4 Cluster analysis results of samples from different parts of peony root

2.5.3 主成分分析(PCA)

為驗證聚類分析結果，進一步采用PCA進行分析。將30批牡丹根不同部位樣品的19個共有峰峰面積導入SIMCA 14.1 軟件，以特征值>1，提取出主成分有5個，其累積貢獻率為89.62%。通過少數貢獻度較大成分，可將30批樣本分為三類，其中須根、連丹皮、刮丹皮基本聚為一類，栓皮聚為一類，木心基本聚為一類，見圖5。以上與聚類分析結果一致。

圖5 牡丹根不同部位樣品主成分分析結果Fig.5 Principal component analysis results of samples from different parts of peony root

2.5.4 偏最小二乘判別分析(PLS-DA)

為篩選30批牡丹根不同部位樣品的組內差異成分，將19個共有峰匹配結果導入 SIMCA 14.1軟件進行PLS-DA分析，變量重要性投影值(variable importance in projection，VIP)結果見圖6。由圖6可知，VIP值>1的成分有10個，說明這10個成分是牡丹根不同部位主要差異性成分，其中1號峰為沒食子酸，17號峰為苯甲酰芍藥苷，14號峰為1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖，13號峰為1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖，10號峰為芍藥苷，16號峰為苯甲酰氧化芍藥苷，7號峰為丹皮酚新苷。

圖6 牡丹根不同部位樣品的PLS-DA的VIP圖Fig.6 VIP map of PLS-DA of samples from different parts of peony root

2.6 牡丹根不同部位特征性成分分析

為進一步探究牡丹根不同部位化學成分分布規律及富集特征，以上述篩選的10個差異性成分中可指認的7個差異性成分及含量大于0.1 mg/g的化學成分作為定量分析指標，分別為沒食子酸、氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚原苷、丹皮酚新苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、牡丹皮苷C、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、丹皮酚13個成分。混合對照品和供試品樣品色譜峰見圖7、圖8。將30批樣品中所測定指標成分的峰面積帶入2.4.5中線性回歸方程計算，得到牡丹根各部位中各成分的含量，其中酚及酚苷類成分含量大致為連丹皮>刮丹皮>須根>栓皮>木心，單萜及其苷類成分大致為栓皮>連丹皮>須根>木心>刮丹皮，鞣酸類成分大致為須根>栓皮>連丹皮>刮丹皮>木心，具體見表3，圖9。

圖7 混合對照品色譜圖Fig.7 Chromatogram of mixed reference substance注：1-沒食子酸；2-氧化芍藥苷；4-沒食子酸甲酯；5-丹皮酚原苷；7-丹皮酚新苷；8-芍藥內酯苷；10-芍藥苷；13-1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖；14-1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖；15-牡丹皮苷C；16-苯甲酰氧化芍藥苷；17-苯甲酰芍藥苷；19-丹皮酚。Note:1-Gallic acid;2-Oxypaeoniflorin;4-Methyl gallate;5-Paeonolide;7-Aplopaeonoside;8-Albiflorin;10-Paeoniflorin;13-1,2,3,6-O-Tetragalloylglucose;14-1,2,3,4,6-O-Pentagal-loylglucose;15-Mudanpioside C;16-Benzoyloxypaeoniflorin;17-Benzoylpaeoniflorin;19-Paeonol.

圖8 供試品樣品色譜峰Fig.8 Chromatographic peaks of the test sample注：各編號對應的化合物同圖7。Note:The compounds corresponding to each number are the same as Fig 7.

圖9 牡丹根不同部位中各組分含量Fig.9 Content of components in different parts of peony root注：各編號對應的化合物同圖7。Note:The compounds corresponding to each number are the same as Fig 7.

表3 牡丹根不同部位中各組分含量測定結果Table 3 Content of components in different parts of peony root(mg/g)

續表3(Continued Tab.3)

3 討論與結論

化學成分是中藥發揮其傳統功效的物質基礎，合理選取指標性成分進行中藥質量控制與評價研究是關鍵步驟。本研究采用特征圖譜對牡丹根在加工過程中分成的五個部位的整體化學信息進行采集，結合化學計量學的評價體系篩選13個差異性特征成分進行含量測定，對牡丹皮根不同部位進行客觀性質量評價。

通過UPLC特征圖譜對牡丹根不同部位化學成分進行整體表征，較為全面地比較了連丹皮、刮丹皮、木心、栓皮、須根的化學信息，通過HCA和PCA分析可以得出連丹皮、刮丹皮、須根三個部位化學成分相似，可聚為一類，木心中化學成分較少，且主要成分如丹皮酚和芍藥苷含量偏低，栓皮中化學成分較為豐富。

通過PLS-DA篩選了牡丹根不同部位10個特征性差異成分，根據對照品指認得沒食子酸、丹皮酚原苷、芍藥苷、1,2,3,6-O-四沒食子酰葡萄糖、1,2,3,4,6-O-五沒食子酰葡萄糖、苯甲酰氧化芍藥苷、苯甲酰芍藥苷等7個成分，同時結合含量大于0.1 mg/g的功效成分(氧化芍藥苷、沒食子酸甲酯、丹皮酚新苷、芍藥內酯苷、牡丹皮苷C、丹皮酚)共13個成分進行含量測定，以酚及酚苷類、單萜及其苷類、鞣酸類組分等類別化學組分分析牡丹根不同部位化學成分分布規律[19]。含量測定結果表明牡丹根不同部位化學成分既有相似性又有差異性，造成差異性的原因可能與牡丹生長過程中次生代謝產物的合成與轉移有關[20]。連丹皮中酚及酚苷類、鞣酸類含量與刮丹皮大致相當，但單萜及其苷類組分含量高于刮丹皮，這與伍淳操等[21]文獻報道一致，說明單萜及其苷類組分主要累積在最外栓皮層，史素影等[22,23]在研究芍藥根不同部位發現單萜苷類成分含量分布栓皮層>韌皮>木質，推測芍藥屬特征性組分單萜苷類次生代謝累積特征相同。栓皮在連丹皮中所占比重較少，但其所含化學成分豐富，單萜苷類成分含量富集。這說明在臨床療效上，連丹皮可能優于刮丹皮，也提示牡丹皮產地加工時保留栓皮部位更為適宜。

非藥用部位木心中有效成分含量比較發現，木心中所測的特征成分含量相對較低，因木心為牡丹根部木質化程度高的部位，去除木心可提高牡丹藥用部位有效成分富集，因此，牡丹皮加工過程中去心具有科學性。非藥用部位須根中酚及酚苷類、單萜及其苷類、鞣酸類組分含量與連丹皮相當，作為非藥用部位舍棄較為可惜，但須根在加工過程中較難與木心完全剝離，且較容易映入灰分部分導致整體產品下降，不易納入藥用部分進行質量控制，可收集須根部位考慮綜合資源開發利用。

藥用植物體內次生代謝物差異積累是不同基源、產地藥材質量差異的核心問題。本研究表明，牡丹根皮是主要功效成分及其次生代謝產物積累的主要器官，牡丹藥用部位為去心的根皮具有科學性，又因栓皮中單萜及其苷類成分含量較高，因此，牡丹產地加工保留栓皮更為合適。非藥用部位須根中各組分含量與連丹皮相差不大，但因其直徑過細，難與木心剝離，且較難對其進行質量控制，而不宜納入藥用部位，但可考慮加工用于日化、獸藥等產業。值得注意的是，單萜及其苷類成分在牡丹根不同部位中差異積累，這可能與牡丹在植物生長中次生代謝產物如何合成并轉運至藥用部位貯藏有關，需要結合轉錄組學等分子生藥學進一步揭示科學內涵，這對于牡丹皮質量評價具有重要意義。