長管紅山茶葉片的化學成分研究

王介華，張文華，肖 強，吳增寶，崔令軍*

1湖北民族大學風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室，恩施 445000；2石河子大學藥學院，石河子 832000

長管紅山茶CamellialongitubaChang為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)多年生小喬木，最早為1990年中山大學張宏達教授報道[1]，模式標本采自湖北恩施地區。據《中國植物志》第四十九卷第三分冊記載，山茶科植物約有36屬、700種，山茶屬是山茶科中最大的一個屬，山茶屬植物在我國有238種，主要分布于西南至東南部，以云南、廣西、廣東及四川最多[2]。山茶屬植物中的化學成分主要為黃酮類、皂苷類、多酚類、植物甾醇類、脂肪酸類和生物堿類等，其中黃酮類成分主要是黃酮醇類，以槲皮素、山柰酚以及兒茶素最為常見；皂苷類成分主要為齊墩果烷型的五環三萜皂苷。生物活性表現在抗菌、抗突變、抗癌、抗潰瘍、抗氧化、降血脂等多方面[3]。

尿素通道蛋白家族(urea transporters，UTs)是一種轉運尿素(urea)的通道蛋白分子，目前已表征的包括UT-A(UT-A1、UT-A2、UT-A3、UT-A4、UT-A5和UT-A6)、UT-B兩個家族[4]，其在腎內尿素循環過程中起重要作用，建立腎髓質組織尿素濃度梯度并參與尿濃縮機制[5]。UT-B敲除模型小鼠的腎內髓組織尿素濃度和滲透壓降低，且尿濃縮能力下降并不影響其他腎功能和機體的其他主要溶質(Na+、K+、Cl-)的清除率[6]。所以，UT-B抑制作用可以在既不引起鉀流失，也不影響體液電解質平衡的情況下增加尿量，本研究通過紅細胞裂解模型進行UT-B抑制劑的篩選。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

薄層色譜分析板(孔山市上段新材料有限公司)；暗箱式紫外分析儀(ZF-20D，鞏義市予華儀器有限責任公司)；Bruker DRX 400 MHz超導核磁共振儀(德國Bruker公司，四甲基硅烷(TMS)為內標)；GF254薄層色譜硅膠(青島海洋化工廠)；半制備高效液相色譜儀(HPLC,島津LC-20)；高速逆流色譜儀(HSCCC，TBE-300C，上海同田生物技術有限公司)；酶標儀(1510，賽默飛世爾)；96孔板(美國康寧公司)；二甲基亞砜(DMSO)(西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司)；有機溶劑為國藥集團上海試劑廠產品，其他試劑為分析純。

長管紅山茶葉片于2019年5月采自湖北省恩施土家族苗族自治州恩施市白果鄉，植物標本經湖北民族大學吳增寶副教授鑒定為山茶科山茶屬植物長管紅山茶CamellialongitubaChang。標本(H20210206)保存于風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室。

1.2 實驗與方法

1.2.1 提取與分離

長管紅山茶葉片陰干粉碎，取10 kg，純水回流提取3次，每次2 h，趁熱過濾，濾液濃縮得浸膏900 g。浸膏硅膠拌樣，采用硅膠柱層析梯度洗脫二氯甲烷/甲醇(10∶1→1∶1)，TLC檢識合并得到2個組分A和B。

A經MDS-300甲醇水(3∶1→1∶1)梯度洗脫，得3個組分依次為Fr.A-1～3，A-1經Sephadex LH-20甲醇水(3∶1→1∶1)洗脫得Fr.A-1-1～12，其經半制備HPLC純化得化合物3(88 mg，tR= 23 min)和4(54 mg，tR= 36 min)。A-3經反相甲醇水(3∶1→1∶1)梯度洗脫得Fr.A-3-1～17。A-3-6經凝膠甲醇水(1∶1)洗脫重結晶得化合物5(963 mg)和7(26 mg)。A-2經凝膠甲醇水(1∶1)洗脫得Fr.A-2-1～8，Fr.A-2-3經反相甲醇水(1∶1)得Fr.A-2-3-1～13。Fr.A-2-3-8經半制備HPLC純化得化合物1(27 mg，tR= 16 min)。

B經MDS-300甲醇水(10∶1→1∶1)梯度洗脫得B-1～10，B-5經中壓反相甲醇水(10∶1→1∶1)梯度洗脫得B-5-1～13，B-5-3經凝膠甲醇水(1∶1)洗脫得B-5-3-1～7，B-5-3-3經半制備HPLC純化得化合物6(41 mg，tR= 19 min)，B-5-3-4經重結晶得化合物2(32 mg)。B-7經反相甲醇水(10∶1→1∶1)得B-7-1～12，B-7-5經凝膠甲醇水(1∶1)得B-7-5-1～9，B-7-5-4經凝膠甲醇水(1∶1)等度洗脫得B-7-5-4-1～7，B-7-5-4-3經HSCCC分離得化合物8(11 mg，tR= 12 min)、9(8 mg，tR= 18 min)、10(43 mg，tR= 23 min)和11(9 mg，tR= 28 min)。

B-8經MDS-300甲醇水(10∶1→1∶1)梯度洗脫得Fr.B-1～9，Fr.B-8-3經Sephadex LH-20凝膠甲醇水(1∶1)等度洗脫得Fr.B-8-3-1～19，Fr.B-8-3-5經凝膠甲醇水(1∶1)洗脫得Fr.B-8-3-5-4，Fr.B-8-3-5-7。Fr.B-8-3-5-4經半制備HPLC乙腈水(1∶1)等度純化得化合物13(23 mg，tR= 15 min)。Fr.B-8-5經反相甲醇水(10∶1～1∶1)梯度洗脫得Fr.B-8-5-1～12，Fr.B-8-5-7經凝膠甲醇水(1∶1)洗脫得Fr.B-8-5-7-1～14，Fr.B-8-5-7-9、Fr.B-8-5-7-10經半制備HPLC甲醇水等度純化得化合物12(7 mg，tR= 14 min)和14(13 mg，tR= 22 min)。Fr.B-8-8經反相甲醇水(1∶1)等度洗脫得Fr.B-8-8-1～9，Fr.B-8-8-6經凝膠甲醇水(1∶1)等度洗脫得Fr.B-8-8-6-1～3，Fr.B-8-8-6-5經半制備HPLC甲醇水純化得化合物15(18 mg，tR= 20 min)。

1.2.2 UT-B抑制物質篩選

將人血樣肝素鈉抗凝處理，離心15 min(3 000 r/min)棄上清，加入10倍體積的等滲磷酸鹽緩沖液(PBS)，離心15 min棄上清。將高滲PBS與紅細胞按照50∶1混合后在室溫下孵育2 h。每個化合物分高濃度(100 μg/mL)和低濃度(50 μg/mL)振蕩培養6 min，使用酶標儀在710 nm波長下檢測吸光度(OD)值，選擇OD值下降明顯的化合物進行梯度實驗，調整紅細胞懸液和化合物的比例，取25 μL化合物，加入175 μL紅細胞懸液中，混合輕微震蕩6 min，取上述化合物和紅細胞的混合液20 μL，加入到180 μL的等滲PBS中，終濃度分別為：500、250、125、62.5、31.25、15.625 μg/mL，在710 nm波長下檢測OD值，按以下公式計算出化合物各濃度的抑制率：抑制率=(ODDMSO-OD樣品)/(ODDMSO-0.045)×100%，取量效關系明顯的化合物計算IC50，DMSO為對照。

2 結果

2.1 結構鑒定

化合物1淡黃色粉末；分子式為C9H8O3；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.51(2H，d，J= 8.5 Hz，H-2′，6′)，7.49(1H，d，J= 15.6 Hz，H-2)，6.79(2H，d，J= 8.5 Hz，H-3′，5′)，6.29(1H，d，J= 15.6 Hz，H-3)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：170.4(C-1)，118.2(C-2)，146.6(C-3)，127.7(C-1′)，132.5(C-2′，C-6′)，117.8(C-3′，C-5′)，162.0(C-4′)。以上數據與文獻[7]報道一致，故鑒定化合物1為對羥基肉桂酸(結構見圖1)。

圖1 化合物1～15的結構Fig.1 Structures of compounds 1-15

化合物2淡黃色粉末；分子式為C21H20O12；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.61(1H，dd，J= 8.6，1.9 Hz，H-2′)，7.54(1H，d，J= 1.9 Hz，H-6′)，6.82(1H，d，J= 8.6 Hz，H-5′)，6.41(1H，d，J= 1.8 Hz，H-6)，6.20(1H，d，J= 1.8 Hz，H-8)，5.37(1H，d，J= 7.7 Hz，H-1′′)，3.26～3.65(1H，m，H-3)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：157.6(C-2)，134.8(C-3)，178.8(C-4)，162.5(C-5)，100.0(C-6)，165.5(C-7)，94.9(C-8)，157.7(C-9)，105.2(C-10)，122.4(C-1′)，116.5(C-2′)，146.2(C-3′)，149.8(C-4′)，117.3(C-5′)，123.3(C-6′)，103.2(C-1′′)，72.5(C-2′′)，74.5(C-3′′)，69.3(C-4′′)，77.1(C-5′′)，61.5(C-6′′)。以上數據與文獻[8]報道一致，故鑒定化合物2為槲皮素-3-O-β-D-半乳糖苷。

化合物3黃色結晶；分子式為C15H10O7；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.09(1H，s，5-OH)，7.86(1H，d，J= 2.5 Hz，H-2′)，7.59(1H，dd，J= 8.5，7.0 Hz，H-6′)，6.90(1H，d，J= 8.5 Hz，H-5′)，6.43(1H，d，J= 2.4 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.4 Hz，H-6)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：145.5(C-2)，136.2(C-3)，176.3(C-4)，156.6(C-5)，98.8(C-6)，164.3(C-7)，95.3(C-8)，164.0(C-9)，104.1(C-10)，123.6(C-1′)，114.7(C-2′)，147.3(C-3′，C-4′)，115.9(C-5′)，121.2(C-6′)。以上數據與文獻[9]報道一致，故鑒定化合物3為槲皮素。

化合物4白色結晶；分子式為C15H14O6，+0.4°(c 0.1，CH3OH)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.69(1H，d，J= 8.8 Hz，H-5′)，6.59(1H，dd，J= 8.4，2.0 Hz，H-6′)，6.72(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，5.89(1H，d，J= 2.4 Hz，H-6)，5.69(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，4.48(1H，d，J= 7.6 Hz，H-2)，3.82(1H，td，J= 15.6，7.6 Hz，H-3)，2.66(1H，dd，J= 15.2，5.2 Hz，H-4′)，2.35(1H，dd，J= 16.0，8.0 Hz，H-4)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：81.5(C-2)，66.8(C-3)，28.0(C-4)，156.9(C-5)，95.7(C-6)，156.6(C-7)，94.3(C-8)，155.8(C-9)，99.5(C-10)，131.1(C-1′)，115.5(C-2′)，145.3(C-3′)，145.3(C-4′)，115.0(C-5′)，118.9(C-6′)。以上數據與文獻[10]報道一致，故鑒定化合物4為(+)-兒茶素。

化合物5白色結晶；分子式為C7H6O4；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.38(1H，d，J= 2.1 Hz，H-4)，7.33(1H，dd，J= 8.2，2.1 Hz，H-2)，6.81(1H，d，J= 8.2 Hz，H-6)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：122.3(C-1)，117.0(C-2)，150.4(C-3)，145.3(C-4)，115.7(C-5)，122.5(C-6)，168.0(C-7)。以上數據與文獻[11]報道一致，故鑒定化合物5為原兒茶酸。

化合物6黃色粉末；分子式為C9H6O4；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.72(1H，s，-OH)，8.18(1H，d，J= 5.9 Hz，H-2)，6.36(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.27(1H，d，J= 5.9 Hz，H-3)，6.20(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：157.9(C-2)，111.0(C-3)，181.7(C-4)，162.2(C-5)，99.6(C-6)，165.4(C-7)，94.6(C-8)，158.4(C-9)，105.3(C-10)。以上數據與文獻[12]報道一致，故鑒定化合物6為5，7-二羥基色原酮。

化合物7黃色結晶；分子式為C27H30O16；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.54(1H，dd，J= 8.0，2.4 Hz，H-6′)，7.51(1H，d，J= 2.4 Hz，H-2′)，6.85(1H，d，J= 8.2 Hz，H-5′)，6.38(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，5.33(1H，d，J= 7.6 Hz，H-1′′)，4.37(1H，d，J= 1.6 Hz，H-1′′′)，3.42(10H，m)，0.98(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6′′′)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：158.2(C-2)，135.2(C-3)，178.6(C-4)，162.8(C-5)，98.8(C-6)，165.8(C-7)，94.9(C-8)，158.6(C-9)，105.1(C-10)，122.8(C-1′)，115.3(C-2′)，145.1(C-3′)，148.6(C-4′)，116.1(C-5′)，120.8(C-6′)，104.8(C-1′′)，75.2(C-2′′)，78.3(C-3′′)，71.5(C-4′′)，77.3(C-5′′)，68.7(C-6′′)，101.6(C-1′′′)，75.6(C-2′′′)，72.5(C-3′′′)，72.8(C-4′′′)，68.7(C-5′′′)，17.6(C-6′′′)。以上數據與文獻[13]報道一致，故鑒定化合物7為蘆丁。

化合物8黃色粉末；分子式為C16H12O7；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.73(1H，d，J= 2.2 Hz，H-5)，7.61(1H，dd，J= 8.5，2.2 Hz，H-6′)，6.96(1H，d，J= 8.5 Hz，H-2)，6.48(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8′)，6.25(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：147.1(C-2)，136.1(C-3)，176.2(C-4)，156.6(C-5)，98.6(C-6)，164.3(C-7)，93.8(C-8)，161.1(C-9)，103.4(C-10)，122.4(C-1′)，115.4(C-2′)，145.4(C-3′)，148.0(C-4′)，115.9(C-5′)，120.5(C-6′)，56.7(OCH3)。以上數據與文獻[14]報道一致，故鑒定化合物8為3-O-甲基槲皮素。

化合物9淡黃色粉末；分子式為C12H8O5；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.17(1H，s，9-OH)，8.18(1H，d，J= 9.8 Hz，H-5)，8.05(1H，d，J= 2.3 Hz，H-2)，7.30(1H，d，J= 2.3 Hz，H-3)，6.33(1H，d，J= 9.8 Hz，H-6)，4.10(3H，s，4-OCH3)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：146.7(C-2)，104.2(C-3)，115.3(C-3a)，146.7(C-4)，105.8(C-4a)，140.4(C-5)，112.9(C-6)，160.4(C-7)，141.7(C-8a)，125.9(C-9)，147.5(C-9a)，61.5(OCH3)。以上數據與文獻[15]報道一致，故鑒定化合物9為9-羥基-4-甲氧基補骨脂素。

化合物10淡黃色固體；分子式為C10H8O4；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.83(1H，s，5-OH)，6.33(1H，d，J= 2.0 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)，6.08(1H，s，H-3)，2.35(3H，s，CH3)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：168.1(C-2)，108.4(C-3)，182.2(C-4)，158.2(C-5)，99.2(C-6)，164.6(C-7)，94.2(C-8)，162.0(C-9)，103.8(C-10)，20.4(-CH3)。以上數據與文獻[16]報道一致，故鑒定化合物10為去甲丁香色原酮。

化合物11黃色粉末；分子式為C15H12O5；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：12.17(1H，s，H-5)，7.32(2H，d，J= 8.2 Hz，H-2′，6′)，6.97(2H，d，J= 8.2 Hz，H-3′，5′)，5.89(1H，d，J= 3.0 Hz，H-6)，5.46(1H，d，J= 3.0 Hz，H-8)，5.42(1H，dd，J= 12.9，2.9 Hz)，3.28(1H，dd，J= 17.2，12.9 Hz)，2.67(1H，dd，J= 17.2，2.9 Hz)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：78.9(C-2)，42.4(C-3)，196.9(C-4)，163.4(C-5)，95.4(C-6)，167.2(C-7)，96.3(C-8)，164.0(C-9)，102.2(C-10)，129.3(C-1′)，128.8(C-2′，6′)，115.6(C-3′，5′)，158.2(C4′)。以上數據與文獻[17]報道一致，故鑒定化合物11為柚皮素。

化合物12黃色結晶；分子式為C15H10O6；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：8.00(2H，m，H-2′，6′)，6.88(2H，m，H-3′，5′)，6.39(1H，d，J= 2.2 Hz，H-6)，6.14(1H，d，J= 2.2 Hz，H-8)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：147.3(C-2)，136.2(C-3)，176.4(C-4)，164.6(C-5)，98.8(C-6)，159.7(C-7)，94.0(C-8)，156.7(C-9)，103.5(C-10)，122.2(C-1′)，130.0(C-2′，6′)，116.0(C-3′，5′)，161.2(C-4′)。以上數據與文獻[18]報道一致，故鑒定化合物12為山柰酚。

化合物13白色粉末；分子式為C15H14O6，+0.4°(c 0.0082，CH3OH)；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.85(1H，d，J= 2.0 Hz，H-2′)，6.63(1H，d，J= 8.0 Hz，H-6′)，6.60(1H，dd，J= 8.0，2.0 Hz，H-5′)，5.85(1H，d，J= 2.3 Hz，H-8)，5.67(1H，d，J= 2.3 Hz，H-6)，4.63(1H，m，H-2)，3.96(1H，s，H-3)，2.63(1H，dd，J= 16.3，4.5 Hz，H-4b)，2.46～2.41(1H，m，H-4a)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：78.6(C-2)，65.4(C-3)，28.7(C-4)，156.3(C-5)，95.6(C-6)，156.8(C-7)，94.6(C-8)，157.1(C-9)，99.0(C-10)，131.1(C-1′)，115.3(C-2′)，145.0(C-3′)，145.0(C-4′)，118.5(C-5′)，115.4(C-6′)。以上數據與文獻[19]報道一致，故鑒定化合物13為(-)-表兒茶素。

化合物14白色粉末；分子式為C7H6O5；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：6.91(2H，s，H-2，6)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：120.9(C-1)，109.2(C-2，6)，145.9(C-3，5)，138.5(C-4)，168.0(C=O)。以上數據與文獻[20]報道一致，故鑒定化合物14為沒食子酸。

化合物15黃色粉末；分子式為C15H10O8；1H NMR(400 MHz，DMSO-d6)δ：7.20(2H，s，H-2′，6′)，6.33(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，6.14(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)；13C NMR(101 MHz，DMSO-d6)δ：147.4(C-2)，136.4(C-3)，176.3(C-4)，156.6(C-5)，98.7(C-6)，164.4(C-7)，93.7(C-8)，161.2(C-9)，103.5(C-10)，121.3(C-1′)，107.7(C-2′，6′)，136.4(C-3′，5′)，146.2(C-4′)。以上數據與文獻[21]報道一致，故鑒定化合物15為楊梅素。

2.2 UT-B抑制活性物質篩選

以健康成人紅細胞為實驗材料，710 nm測定各化合物的吸光度(OD)值，計算抑制率。抑制率高于40%的化合物視為具有UT-B抑制活性，得到化合物3、7、13、14和15抑制率高于40%，具有UT-B抑制活性。其中量效關系明顯的是化合物14和化合物15，化合物14對紅細胞抑制率的IC50為2.373 μg/mL，化合物15對紅細胞抑制率的IC50為2.521 μg/mL，有利尿活性。

3 結論

長管紅山茶作為山茶屬的新成員，其化學成分此前一直處于空白狀態。為進一步探討長管紅山茶藥效基礎物質，本研究對其化學成分進行研究，得到了15個單體化合物，其中9個黃酮類化合物，3個酚酸類化合物，2個色原酮及其衍生物，1個香豆素類化合物，并結合質譜、核磁共振波譜等技術闡明了其化學結構。15個化合物均是首次從長管紅山茶植物中分離得到，且化合物1、6、7、8、9、10和11為首次從山茶屬中分離得到。從所分離得到的化合物類型來看，和山茶屬的化合物類型基本吻合，以黃酮和酚酸類為主。對化合物進行UT-B抑制活性物質篩選，結果表明沒食子酸(14)和楊梅素(15)具有較明顯的利尿活性。因此在后續工作中應對此類化合物的作用機制進行深入的研究。本文為長管紅山茶的藥理研究提供了物質基礎，也為長管紅山茶的開發應用提供參考。