假蒟葉的生物堿類成分研究

邵金華，劉依林，呂敬崑，陳小明,*

1湖南科技學院化學與生物工程學院；2湖南省銀杏工程技術研究中心；3湖南恒偉藥業股份有限公司，永州 425100

假蒟(Pipersarmentosum)別名假蔞、蛤蒟、蓽拔子等，隸屬胡椒科胡椒屬，為多年生、匍匐、逐節生根草本，廣泛分布于廣東、廣西及云南等省份，其作為藥食兩用植物在我國擁有悠久的使用歷史[1，2]。假蒟味辛、性溫，具有祛風散寒、行氣止痛等功效，以根入藥可用于治療瘡腫癰毒、風濕骨痛、跌打損傷和風寒咳嗽等病癥[3]，其嫩莖葉在中國南方部分地區被當作蔬菜食用[4]。研究表明，假蒟中含有生物堿、黃酮以及酚類等多種化學成分[5-7]，相應被報道的生物活性有抗炎[8]、抑菌[9]、抗抑郁[10]、抗氧化[11]和神經保護[12]等。

從天然產物中尋找抗菌化合物或組分是抗致病微生物藥物發現及應用的重要來源和途徑[13]。Yuan等[14]采用生長速率法測試了2 mg/mL的假蒟葉甲醇提取物對香蕉炭疽病菌等9種植物病原真菌的抑制活性，結果顯示該濃度下假蒟葉甲醇提取物具有良好的抑菌效果，抑菌率均達50%以上。Zaidan等[15]研究發現，假蒟的甲醇提取液能夠有效抑制金黃色葡萄球菌和肺炎克雷伯氏菌等致病菌的生長。Liu[16]從假蒟全草70%甲醇提取物中分離鑒定了4個對新型隱球菌(Cryptococcusneoformans)具有不同程度抑制活性的生物堿類成分。

綜上所述，可知假蒟中存在抗菌活性結構成分，以往的研究證實了假蒟所含的生物堿類化合物具有較大的抑菌活性潛力[17]。為了進一步研究假蒟葉中的化學成分及其生物活性，本實驗對假蒟葉的總生物堿提取物進行研究，并篩選了所有分離得到化合物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，旨在為假蒟植物資源的進一步開發利用提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

GCMS-QP2020 NX單四極桿型氣相色譜質譜聯用儀(日本島津公司)；AVANCE 400 NMR及600 NMR核磁共振儀(德國Bruker公司)；AVATAR-360傅立葉紅外光譜儀(美國Nicolet Instrument Corporation公司)；Cary 3500紫外可見分光光度計(美國安捷倫公司)；Waters Breeze2 1525EF分析兼半制備高效液相色譜儀(美國Waters公司)；RP-18反相柱色譜硅膠和C18色譜柱(5 μm，250 mm × 10 mm；日本YMC公司)；柱色譜正向硅膠及硅膠GF254薄層板(青島海洋化工有限公司)；色譜乙腈、甲醇(美國Tedia公司)；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠(Pharmacia Biotech公司)；LB培養基(Miller)；水為超純水；所用其他分析純試劑均為西隴化工股份有限公司產品。

1.2 植物材料

假蒟地上部分于2021年6月采集于云南省西雙版納，由湖南科技學院姜紅宇副教授鑒定為胡椒屬植物假蒟(Pipersarmentosum)，植物標本(PS-20210612)保存于湖南科技學院“湘南優勢植物資源綜合利用湖南省重點實驗室”。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取與分離

取干燥的假蒟葉5.0 kg，使用中藥粉碎機將其粉碎，并用95%乙醇在室溫條件下進行滲漉提取，提取液經減壓濃縮得到總浸膏(328.5 g)。浸膏加入適量水混懸，用10%的鹽酸溶液調節pH值至2～3，氯仿萃取，酸水層用氨水調節pH至9～10，氯仿萃取，萃取液經減壓濃縮即得總生物堿部位(10.8 g)。總生物堿部位采用硅膠柱層析脫除色素并進行極性分段，以二氯甲烷-甲醇(100∶0→0∶100)梯度洗脫，分離得到12個流分(Fr.A～Fr.L)。Fr.G(1.2 g)經Sephadex LH-20葡聚糖凝膠柱色譜，甲醇洗脫得到7個流分(Fr.G-1～Fr.G-7)。Fr.G-3(320.8 mg)經半制備型HPLC分離純化(35%乙腈-水，流速2.0 mL/min)得到化合物1(tR= 40.8 min，15.0 mg)和3(tR= 35.0 min，29.8 mg)。Fr.G-5(167.4 mg)經半制備型HPLC分離純化(35%乙腈-水，流速2.0 mL/min)得到化合物2(tR= 27.4 min，39.5 mg)和4(tR= 42.7 min，11.3 mg)。Fr.H(2.1 g)經反相ODS柱色譜，甲醇-水(35∶65→100∶0)梯度洗脫得到10個流分(Fr.H-1～Fr.H-10)。Fr.H-3(153.5 mg)經Sephadex LH-20凝膠柱色譜(甲醇)以及半制備型HPLC分離純化(40%甲醇-水，流速2.0 mL/min)得到化合物6(tR= 38.6 min，10.2 mg)、7(tR= 40.0 min，8.7 mg)和5(tR= 52.6 min，15.0 mg)。

1.3.2 抗菌活性評價

以硫酸卡那霉素為陽性對照，采用微量二倍稀釋法[18]測定化合物1～7的最低抑菌濃度(MIC)。使用DMSO溶解化合物，配制濃度為4.0 mg/mL的母液備用。在96孔板第1列、第2列、第3列、第4至12列每孔分別加入200、100、190、100 μL的LB液體培養基，在第3列每孔加入樣品10 μL，吹打混勻，再從第3列吸取100 μL至第4列，吹打混勻后，按上述操作依次2倍稀釋至第12列，第12列吸取100 μL棄去。使用滅菌后的LB培養基稀釋金黃色葡萄球菌液至1×105CFU/mL，除第一列外，每孔加入100 μL稀釋菌液，使各化合物終濃度分別為：100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56、0.78、0.39和0.19 μg/mL。將96孔板置于37 ℃恒溫箱培養16 h，觀察檢定菌培養基渾濁度，培養基最澄清的最低藥物濃度即為該化合物的MIC。

2 實驗結果

2.1 結構鑒定

表1 化合物1的氫譜和碳譜數據(600和150 MHz，CD3OD)Table 1 1H and 13C NMR data of compound 1(600 and 150 MHz,CD3OD)

通過對比發現，化合物1與3(chaplupyrrolidone B)的核磁數據較為相似，兩者的區別在于C-5位所連取代基團的不同。化合物1比3多出一個連氧亞甲基信號，根據1H-1H COSY譜中δH1.13(3H，t，J= 7.2 Hz，5-OCH2CH3)與δH3.71，3.60(2H，m，5-OCH2CH3)的相關信號確定了乙氧基結構片段的存在，根據HMBC譜中δH6.02(1H，br d，H-5)與δC64.9(5-OCH2CH3)等相關信號確定乙氧基連接在C-5，至此化合物1的平面結構被確定(見圖1)。化合物1的旋光值([α]-5.8)顯示為負值，通過與文獻報道的化合物chaplupyrrolidone A(2)和chaplupyrrolidone B(3)對比ECD譜圖、核磁數據以及旋光數據[19]，確定其絕對構型為5S。并將其命名為chaplupyrrolidone C，是1個新的苯丙酰胺類生物堿。化合物1的詳細結構鑒定數據原始圖譜可從本刊官網免費下載(www.trcw.ac.cn)。

圖1 化合物1的主要1H-1H COSY和HMBC相關Fig.1 Key 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物4無色油狀液體(CH3OH)；HR-ESI-MS：m/z216.103 8 [M+H]+(calcd for C13H14NO2，216.101 9)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.30(5H，overlapped，H-5′，H-6′，H-7′，H-8′，H-9′)，7.30(1H，overlapped，H-4)，6.15(1H，dt，J= 6.0，2.0 Hz，H-3)，4.40(2H，t，J= 2.0 Hz，H-5)，3.28(2H，t，J= 7.6 Hz，H-2′)，3.00(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：170.2(C-2)，127.6(C-3)，146.8(C-4)，50.8(C-5)，172.6(C-1′)，38.0(C-2′)，30.2(C-3′)，141.7(C-4′)，128.5(C-5′/9′)，128.7(C-6′/8′)，126.0(C-7′)。以上數據與文獻[20]報道基本一致，故鑒定化合物4為sarmentamide A。

化合物5黃色粉末狀固體(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z200.105 8 [M+H]+(calcd for C13H14NO，200.107 0)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.28(7H，overlapped，H-5′，H-6′，H-7′，H-8′，H-9′，H-2，H-5)，6.26(2H，t，J= 2.4 Hz，H-3，H-4)，3.12-3.10(4H，m，H-2′，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：118.8(C-2/5)，113.2(C-3/4)，164.6(C-1′)，36.5(C-2′)，30.2(C-3′)，140.1(C-4′)，128.8(C-5′/9′)，128.3(C-6′/8′)，126.4(C-7′)。以上數據與文獻[3]報道基本一致，故鑒定化合物5為N-(3-phenylpropanoyl) pyrrole。

化合物6白色粉末狀固體(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z276.123 1(calcd for C15H18NO4，276.123 0)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.28(2H，br s，H-2，H-5)，6.43(2H，s，H-5′，H-9′)，6.21(2H，t，J= 2.4 Hz，H-3，H-4)，5.65(7′-OH)，3.80(6H，s，6′-OCH3，8′-OCH3)，3.07(2H，t，J= 7.6 Hz，H-2′)，2.95(2H，t，J= 7.6 Hz，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：118.5(C-2/5)，113.0(C-3/4)，169.6(C-1′)，36.4(C-2′)，30.2(C-3′)，131.0(C-4′)，104.8(C-5′/9′)，146.8(C-6′/8′)，133.0(C-7′)，56.0(6′-OCH3，8′-OCH3)。以上數據與文獻[3,21]報道基本一致，故鑒定化合物6為3-(4-hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) propanoylpyrrole。

化合物7白色粉末狀固體(甲醇)；HR-ESI-MS：m/z290.139 5(calcd for C16H20NO4，290.138 7)；1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：7.31(2H，br s，H-2，H-5)，6.46(2H，s，H-5′，H-9′)，6.28(2H，t，J= 2.4 Hz，H-3，H-4)，3.85(6H，s，6′-OCH3，8′-OCH3)，3.82(3H，s，7′-OCH3)，3.14(2H，m，H-2′)，3.05(2H，m，H-3′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：118.8(C-2/5)，113.5(C-3/4)，169.7(C-1′)，36.7(C-2′)，30.6(C-3′)，136.2(C-4′)，105.5(C-5′/9′)，153.4(C-6′/8′)，136.1(C-7′)，61.0(7′-OCH3)，55.2(6′-OCH3，8′-OCH3)。以上數據與文獻[21]報道基本一致，故鑒定化合物7為3-(3,4,5-trimethoxyphenyl) propanoylpyrrole。

化合物1～7的結構見圖2。

圖2 化合物1～7的化學結構式Fig.2 The chemical structures of compounds 1-7

2.2 抗菌活性測試結果

采用微量二倍稀釋法測定了化合物1～7的最小抑菌濃度，結果如表2所示，化合物1～4對金黃色葡萄球菌具有中等程度的抑制活性，其MIC值在6.25～25 μg/mL之間。化合物5～7對金黃色葡萄球菌無明顯抑制活性。

表2 化合物1～7對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度Table 2 MIC of compounds 1-7 against S.aureus

3 結論

本實驗對假蒟葉總生物堿提取物的化學成分及其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性進行研究，共分離鑒定了7個生物堿類化合物。其中，化合物1是一個新的苯丙酰胺類生物堿，化合物7為首次從假蒟中分離得到。采用微量二倍稀釋法對分離得到的7個化合物進行了抗菌活性測試，結果表明化合物1～4對金黃色葡萄球菌具有中等程度的抑制活性，由此推測化合物1～4是假蒟發揮體外抑菌活性的重要物質基礎之一。本實驗開展了假蒟葉化學成分和抗菌活性研究，為假蒟植物資源合理開發利用提供參考依據。