高產(chǎn)纖維素酶芽孢桿菌的篩選、鑒定與發(fā)酵條件優(yōu)化

楊艷紅，張浩鉑，姚心怡，賀 禧，王 哲

1重慶理工大學藥學與生物工程學院，重慶 400054；2重慶市育才中學，重慶 400050

近年來，隨著石化燃料的無限使用，全球油價劇烈波動，嚴重影響人類的日常生活[1]。人們越來越關注新的替代能源的研究和開發(fā)，纖維素生物質燃料是目前公認的最具生產(chǎn)價值和發(fā)展前景的可再生能源[2]。纖維素生物質是地球上分布最廣、含量最豐富的生物質，主要由纖維素、半纖維素，木質素組成[3]。但纖維素、半纖維素和木質素是通過氫和共價鍵緊密結合，具有頑固性生物質結構，我們僅開發(fā)了不到2%的纖維素資源[4,5]。利用現(xiàn)代生物技術將纖維素轉化為乙醇等液體燃料，產(chǎn)量穩(wěn)定、可再生和無污染，有希望解決能源危機、環(huán)境污染和糧食危機等問題[6]。但要解決這一問題，最關鍵的是要獲得高效、低廉的纖維素酶。

纖維素酶(cellulase)是降解纖維素生成單糖或多糖的一組復合酶系的總稱，主要包括內(nèi)切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-1,4葡萄糖苷酶，3種酶相互協(xié)同降解纖維素物質[7]。目前，對纖維素酶產(chǎn)生菌的研究主要集中在真菌如木霉屬、青霉屬和曲霉屬等，而其纖維素酶多數(shù)結合在細胞膜上，使用很不方便，且酶的分離提取成本太高。并且真菌纖維素酶不僅生產(chǎn)周期長，產(chǎn)生的纖維素酶大多也要在較高溫度條件下才能發(fā)揮較好的效能，室溫或較低溫度下，酶活力都非常低[8]。細菌相對于真菌生長速度快，能獲得更高表達量的重組酶，能生產(chǎn)更復雜的糖苷水解酶系進行酶解協(xié)同反應。同時，細菌具有極高的自然多樣性，更有可能產(chǎn)生耐熱的、堿穩(wěn)定性酶等[9,10]。到現(xiàn)在為止，研究較多的產(chǎn)纖維素酶的細菌有：弧菌、芽孢桿菌、擬桿菌、纖維素單胞菌、梭狀芽孢桿菌、歐文氏菌、瘤胃球菌和熱單胞菌[11]。

目前為止，雖然已經(jīng)做了大量的木質纖維素的轉化研究，但是由于半纖維素酶和纖維素酶的商業(yè)成本非常高，把纖維素生物質轉化成生物乙醇仍面臨巨大挑戰(zhàn)[12]。因此，開發(fā)新型、高效、低成本的纖維素酶迫在眉睫，選育纖維素酶高產(chǎn)菌株尤其重要[13]。從實驗室保存菌株中篩選出纖維素酶高產(chǎn)細菌菌株，對其進行鑒定研究，為纖維素酶制劑研究提供菌株來源和為遺傳改良、基因工程菌株的構建等工作奠定一定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

42株菌株為重慶理工大學藥學與生物工程學院發(fā)酵工程實驗室保存；葡萄糖、剛果紅等常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。其他主要試劑包括：DNA 提取試劑盒、1×TSE101金牌mix、TSINGKE高純度低電滲瓊脂糖、DNA 凝膠回收試劑盒(北京擎科生物科技有限公司，貨號分別為：TSP101-200；1×TSE101；TSJ001；TSP601-50)。

主要儀器設備：HS-1300U水平雙人單面凈化工作臺(上海蘇凈有限公司)；ZQZY-88CES全溫振蕩培養(yǎng)箱(上海知楚儀器有限公司)；WFZ UV-2100紫外分光光度計(上海尤尼柯儀器有限公司)；GI54DWS立式壓力蒸汽滅菌器(美國ZEALWAY)；GL10MD大容量高速離心機(湘儀離心機有限公司)；3730XL測序儀(美國Applied Biosystems)；Legend Micro17離心機(美國Thermo)；2720 thermal cycler PCR儀(美國Applied Biosystems)；JY300 C電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；JY04S-3C凝膠成像儀(北京君意東方電泳設備有限公司)。

篩選培養(yǎng)基：CMC-Na 0.4 g、NH4NO31.0 g、MgSO4·7H2O 0.5 g、K2HPO40.5 g、KH2PO40.5 g、NaCl 1.0 g、CaCl20.1 g、FeCl30.02 g、酵母膏 0.05 g、水100 mL，pH 7.0～7.2。牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏：0.3 g，蛋白胨：1.0 g，NaCl：0.5 g，蒸餾水100 mL，pH 7.0。菌種鑒定培養(yǎng)基：參見《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]。

1.2 方法

1.2.1 初篩

把各個菌株點種于篩選培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng) 3 d，用0.1%剛果紅試劑染色，5 min后用1 mol/L NaCl溶液脫色。挑選菌落周圍出現(xiàn)清晰的透明水解圈的菌株繼續(xù)進行純化與復篩。

1.2.2 純化與復篩

1.2.3 菌株形態(tài)與染色及菌落形態(tài)觀察

將復篩出的分離菌株劃線接種于牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板，置30 ℃培養(yǎng) 1～2 d，參照《現(xiàn)代微生物學實驗技術》[15]，觀察分離菌株菌體形態(tài)與其他特征。

1.2.4 生理生化特征

參照文獻《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]和《現(xiàn)代微生物學實驗技術》[15]進行。

1.2.5 16S rDNA序列測定

把各個菌株培養(yǎng)至對數(shù)期，嚴格按照DNA提取試劑盒操作，獲得基因組DNA，DNA樣品適量稀釋后作為PCR模板進行PCR反應，DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化。純化產(chǎn)物送北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行全序列測序。序列通過NCBI網(wǎng)站中的BLAST程序與GenBank中的核酸數(shù)據(jù)進行比對分析。根據(jù)比對結果，從數(shù)據(jù)庫中選取與所分析的細菌基因序列同源性較高的已知相關序列，采用MEGA 11.0軟件進行多重序列比對分析，用鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.6 AF1菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

活力定義：以濾紙為底物，在一定反應條件(pH 6.0，45 ℃，恒溫30 min)下，以水解反應中，1 g發(fā)酵固體產(chǎn)生的纖維素酶1 min催化纖維素生成1 μg葡萄糖為1個濾紙酶活單位，以U表示。

濾紙酶活力測定方法：采用DNS法[14]。

對上述篩選到產(chǎn)酶活力最大的AF1菌株的固體發(fā)酵培養(yǎng)基進行優(yōu)化篩選。先預實驗確定最佳纖維素粉為玉米秸稈粉，最佳遲效氮源蛋白胨和麩皮。在此基礎上對培養(yǎng)基的主要成分進行13因素3水平的正交實驗優(yōu)化，固體發(fā)酵從第1 d開始取樣，每24 h取一次樣，直到測定濾紙酶活下降為止，以最高濾紙酶活為指標進行直觀分析和方差分析。

1.2.7 AF1菌理化因素發(fā)酵條件篩選

先經(jīng)預實驗初步確定發(fā)酵條件為pH 6.5，溫度35 ℃。然后以pH、溫度和接種量為考察因素進行進一步正交優(yōu)化，取樣檢測具體方法同“1.2.6”。以最高濾紙酶活為指標進行直觀分析。

2 結果與分析

2.1 初篩和復篩

42株菌株點種于篩選培養(yǎng)基初篩，發(fā)現(xiàn)有16個菌落周圍有明顯水解圈。初篩菌株純化和產(chǎn)酶復篩后，根據(jù)水解圈直徑與菌落直徑之比，篩選出5株相對酶活較高的菌株(水解圈直徑/菌落直徑≥4.5)。本實驗室為了菌株管理方便，根據(jù)菌株分離的樣品來源地或者菌株特性對5株菌分別進行編號為：B4、AF1、RC1、B1和ZB6。其中AF1菌株的活性最高(水解圈直徑/菌落直徑=8.04)，見表1和圖1。菌株B4分離自重慶南川區(qū)含有很多落葉的水塘淤泥；菌株ZB6分離自重慶南川一飼喂紅薯藤等雜食養(yǎng)豬場的豬糞；菌株AF1分離自實驗室PDA平板上；RC1分離自重慶市榮昌養(yǎng)豬場的豬糞、B1分離自重慶理工大學食堂餐廚垃圾。

表1 5株產(chǎn)纖維素酶細菌水解圈與菌落直徑比較Table 1 Hydrolysis circle and colony diameter of five strains producing cellulase

圖1 產(chǎn)酶細菌的平板復篩實驗Fig.1 Plate screening test of cellulase-producing strains

2.2 菌落形態(tài)及個體形態(tài)

復篩分離的5株菌株菌落均呈圓形，乳白色，大小不等，多數(shù)中心隆起，邊緣有的整齊、有的呈鋸齒狀、有的不規(guī)則，表面有的濕潤且黏稠、有的表面干燥且有皺褶(見圖2)。菌體革蘭氏染色均為陽性，均為桿狀，有的長桿狀、有的短桿狀，均有芽孢中生，芽孢不大于菌體橫徑，各菌體形態(tài)特征具體見表2。

圖2 5株復篩菌株的菌落形態(tài)Fig.2 Colony morphology of five rescreening strains

表2 5株復篩菌株的菌落形態(tài)和菌體特征Table 2 Colony morphology and cell characteristics of five rescreening strains

2.3 生理生化特征

復篩出的5株菌株的生理生化特征試驗結果見表3。常規(guī)項目中，5株菌株除了運動性、V-P試驗存在差別，其他項目都相同，且相同的項目中只有吲哚實驗呈陰性，其余項目全部呈陽性。糖利用試驗結果發(fā)現(xiàn)：這5株菌株除了B4菌株對木糖利用能力一般，其余菌株對五碳糖木糖和阿拉伯糖的利用能力都非常好，由此推測：這幾株分解纖維素的菌株之所以對五碳糖木糖和阿拉伯糖有利用偏好，這是因為五碳糖木糖和阿拉伯糖是組成半纖維素的重要單糖，而半纖維素又像粘合劑一樣附著在纖維素上對其起保護作用[16]。而這些菌株為了利用纖維素，則先產(chǎn)生半纖維素酶分解利用半纖維素，破壞保護纖維素的外殼，使得纖維素可以更多地暴露出來，然后再產(chǎn)生纖維素酶進一步分解纖維素。對于六碳單糖，5株菌株對葡萄糖、果糖和半乳糖都能利用或者較好地利用；對于二糖，除了RC1不能利用蔗糖而外，其他菌株對蔗糖、麥芽糖、乳糖和海藻糖都能利用或者較好地利用；對于淀粉，五株菌株都能利用，其中RC1對淀粉利用最好。

表3 5株復篩菌株的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of five rescreening strains

續(xù)表3(Continued Tab.3)

綜合5株菌株的形態(tài)特征及生理生化特性，《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》[14]中相應屬、種的有關性狀，可將五株菌株全部歸入芽孢桿菌屬(Bacillus)。

2.4 菌株 16S rDNA 鑒定結果

以各菌株的總DNA為模板，用16S rDNA通用引物進行PCR擴增各個菌株16S rDNA片段，得到5個菌株的DNA片段分別為：B1(1 451 bp)、B4(1 449 bp)、AF1(1 475 bp)、RC1(1 450 bp)和ZB6(1 449 bp)。它們在GenBank中的登錄號分別為：OM756734、OM755768、KM373520、OM756735和OM756736。

經(jīng)各菌株16S rDNA序列在GenBank中作同源性檢索分析，5株分離菌16S rDNA序列與GenBank 中已注冊參考菌株的16S rDNA序列同源性均高于99.5%，從中選取部分同源性較高的菌種，用MEGA11.0構建的系統(tǒng)發(fā)育樹(見圖3)，分析發(fā)現(xiàn)：菌株B4、AF1和RC1是解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)，B1和 ZB6是枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。

圖3 5株菌的16S rDNA全序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic neighbor-joining tree based on 16S rDNA sequence of five strains注：步長值為1 000，節(jié)點上的頻率大于50%的保留，括號中的數(shù)字表示序列在GenBank中的登錄號。Note:Bootstrap percentage values (>50%) based on 1 000 tree replications are indicated at the branching points.The numbers in parentheses represent the sequence′s login number in GenBank.

2.5 AF1菌固體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

培養(yǎng)基篩選的正交試驗結果如表4所示。由極差值R可以得出各因素對菌株AF1產(chǎn)酶活力的影響程度由大到小依次為：水> NaCl >CaCl2> 玉米秸稈粉>麩皮>吐溫80>MgSO4·7H2O >(NH4)2SO4>KH2PO4>蛋白胨>糖蜜>吐溫20。由正交分析得出AF1菌的固體發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配比為：玉米秸稈粉20 g水125 mL，NaCl 0.4 g，CaCl20.2 g，麩皮32 g，吐溫80 0.2 g，蛋白胨0.7 g ，(NH4)2SO40.8 g ，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，糖蜜0.4 g，吐溫20 0.4 g。

表4 AF1菌發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實驗結果Table 4 Results of orthogonal test on medium components of AF1 strain

續(xù)表4(Continued Tab.4)

根據(jù)表5方差分析進行因素顯著性判斷可見，玉米秸稈粉、NaCl、CaCl2和水對AF1菌濾紙酶活有非常顯著影響。在上述正交優(yōu)化結果中，玉米秸稈粉和NaCl的最優(yōu)水平在中間水平，可以不做篩選；而水和CaCl2的最優(yōu)水平則處于邊緣水平即皆為第一水平，可以在第一水平附近進一步設置不同梯度做進一步篩選。同時為了驗證正交實驗結果的可靠性，選擇正交實驗結果表4中最好的6號實驗和優(yōu)化方案做對比，進行驗證實驗，補充實驗設計及結果見表6。

表5 發(fā)酵培養(yǎng)基成分正交實驗方差分析Table 5 Variance analysis of orthogonal test on medium components

根據(jù)表6可以看出，正交優(yōu)化結果可靠，最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基方案為3號，即：玉米秸稈粉20 g，水115 mL，NaCl 0.4 g，CaCl20.2 g，麩皮32 g，吐溫80 0.2 g，蛋白胨0.7 g，(NH4)2SO40.8 g ，KH2PO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.04 g，糖蜜0.4 g ，吐溫20 0.4 g，酶活最高可達到26.52 U/g。

表6 正交補充實驗結果Table 6 Results of supplement tests

2.6 AF1菌理化因素發(fā)酵篩選

發(fā)酵理化條件篩選采用正交試驗，結果見表7，由極差值R可以得出各因素對產(chǎn)酶活力影響由大到小依次為：pH >溫度 >接種量。同時，正交分析得出AF1菌的固體發(fā)酵條件為：溫度30 °C，pH 6.5，接種量1.5%(OD600=1.0)。

表7 理化條件篩選結果Table 7 Results of orthogonal tests on physical and chemical factors

AF1菌在上述確定的最佳培養(yǎng)基和最佳理化條件下進行發(fā)酵，做三個平行組，取不同發(fā)酵時間的樣品測定濾紙酶活，并取平均酶活，做酶活隨發(fā)酵時間的變化曲線，確定最佳發(fā)酵時間，結果如圖4所示：在前36 h內(nèi)濾紙酶活隨發(fā)酵時間緩慢上升，36 h至42 h之間，濾紙酶活迅速增加，到42 h到達26.904U/g，42 h以后濾紙酶活迅速下降。

圖4 酶活隨發(fā)酵時間的變化曲線Fig.4 Curve of enzyme activity with fermentation time

3 結論

本研究從實驗室保存菌株中共篩選出5株高產(chǎn)纖維素酶的細菌，經(jīng)形態(tài)、生理生化特征和16S rDNA分析鑒定，均為芽孢桿菌屬，2 株枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，3株解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。自然界中許多真菌和細菌都能產(chǎn)生多種纖維素酶。目前，對真菌纖維素酶的研究比較多，市場上的纖維素酶也主要來源于真菌。產(chǎn)纖維素酶細菌也由于其很強的適應性和其他優(yōu)點而引起極度關注，它們很可能成為工業(yè)上非常重要的纖維素酶來源。其中芽孢桿菌能產(chǎn)生和分泌大量胞外酶而成為研究的主要細菌，此外，它們還能在纖維素基質生長緩慢的條件下形成內(nèi)生孢子和次級代謝產(chǎn)物使得它們占據(jù)競爭優(yōu)勢，其中枯草芽孢桿菌又是報道最多的纖維素酶優(yōu)良產(chǎn)生菌[17]，解淀粉芽孢桿菌鮮有報道。

本文在剛果紅-CMC平板上其水解圈直徑與菌落直徑比值均大于4.5，最小的ZB6為4.61，最大AF1菌的比值達到了8.04，遠遠超過現(xiàn)有國內(nèi)外文獻報道的用相同方法篩選出的高酶活細菌菌株[9,18-21]。其中文獻報道最大酶活是Tang等[21]從長足大竹象的腸道分離出一株菌株PX19，其最高酶活菌株的水解圈直徑與菌落直徑比值也只有4.83。通過對AF1菌的產(chǎn)纖維素酶固體發(fā)酵條件優(yōu)化篩選后，其最高濾紙酶活可以達到26.904 U/g。除此之外，經(jīng)前期研究團隊研究發(fā)現(xiàn)，AF1菌還能產(chǎn)生高活性的淀粉酶、蛋白酶和廣譜抗菌活性物質，用于雛雞飼喂能顯著提高飼料轉化率，抑制病原菌生長，減少疾病發(fā)生，降低死亡率，是一株具有多功能的強大菌株[22-25]，具有很大開發(fā)潛能。