黃連種子內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及功能驗(yàn)證

向益青，廖海浪，李 娜，鐘芙蓉，彭茂瑤，馬云桐*

1西南特色中藥資源國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，成都 611137；3四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物育種栽培研究所，成都 611300

種子是植物的重要繁殖器官，在種質(zhì)資源保存和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要意義。種子內(nèi)生菌與種子關(guān)系緊密，存在于種子的不同部位(種皮、胚、胚乳)以及種子的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育階段[1]。不同來(lái)源種子中微生物分類群之間高度重疊，種子內(nèi)發(fā)現(xiàn)的內(nèi)生菌分屬4門131屬[2]，其中變形菌門和γ-變形菌門是不同種子內(nèi)的優(yōu)勢(shì)類群，而芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、類芽孢桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、泛菌屬等在不同植物種子內(nèi)最為常見(jiàn)。丹參[3]、水稻[4]、紫花苜蓿[5]等種子內(nèi)生菌種類豐富，攜帶大量功能基因，并通過(guò)直接或間接作用促進(jìn)種子發(fā)育。種子內(nèi)生菌具有多種與種子發(fā)育和萌發(fā)相關(guān)的生理功能，通過(guò)固氮、溶磷、產(chǎn)生植物激素、ACC 脫氨酶、產(chǎn)生鐵載體、促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收等促進(jìn)種子發(fā)育和植物生長(zhǎng)[6]，以及產(chǎn)生抗生素、產(chǎn)生水解酶(果膠酶、淀粉酶、纖維素酶等)、誘導(dǎo)防御機(jī)制等促進(jìn)種子內(nèi)部物質(zhì)轉(zhuǎn)化[7]、降低生物或非生物脅迫對(duì)植物的危害[8]。

黃連CoptischinensisFranch.為毛茛科黃連屬多年生草本植物，以干燥根莖入藥，是許多中成藥的原料之一，人工栽培面積大。然而，黃連種子具有形態(tài)和生理后熟特性，自植株上脫落后需經(jīng)歷9個(gè)月的變溫層積才能成熟萌發(fā)，且發(fā)芽率低；在貯藏中不耐脫水[9]，給種子保存和質(zhì)量控制以及黃連引種栽培等帶來(lái)困難，進(jìn)而影響藥材產(chǎn)量和品質(zhì)。課題組前期宏基因組研究發(fā)現(xiàn)，黃連種子具有豐富的內(nèi)生菌，其可能參與氧化磷酸化、三羧酸循環(huán)、磷酸戊糖、糖酵解-糖異生等途徑，這些途徑與種子發(fā)育及植物生長(zhǎng)聯(lián)系密切，推測(cè)微生物在黃連種子后熟和萌發(fā)過(guò)程中可能發(fā)揮作用。

為深入挖掘黃連種子促生內(nèi)生菌，本研究從黃連種子中通過(guò)平板分離獲得可培養(yǎng)內(nèi)生菌，16S rRNA對(duì)黃連種子內(nèi)生菌進(jìn)行鑒定，對(duì)獲得的菌株進(jìn)行溶磷、固氮和產(chǎn)IAA等促生特性測(cè)定，結(jié)合種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行內(nèi)生菌促生功能驗(yàn)證。以期篩選有益于種子后熟和萌發(fā)的內(nèi)生菌，旨在為揭示植物內(nèi)生菌的促生機(jī)制和頑拗性種子后熟與萌發(fā)機(jī)制提供一定的理論依據(jù)，同時(shí)也為新型、高效的微生物菌肥的研究與開(kāi)發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃連種子于2020年5月采自四川省峨眉山市龍池鎮(zhèn)富有村黃連種植基地(E103.286，N29.454)，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)馬云桐教授鑒定為毛茛科植物黃連(CoptischinensisFranch.)的健康種子。采回種子保存于經(jīng)滅菌處理后的濕潤(rùn)細(xì)沙中后熟，于2020年12月取后熟完成后的種子為本次實(shí)驗(yàn)材料。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

內(nèi)生細(xì)菌分離培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基，R2A培養(yǎng)基；溶磷實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：以Ca3(PO4)2為磷源的無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基：PVK培養(yǎng)基[10](Pikovskaya medium)，NBRIP培養(yǎng)基[11](National Botanical Research Institute′s phosphate growth medium)，以植酸鈣為磷源的有機(jī)磷培養(yǎng)基：植酸鈣培養(yǎng)基[12]；固氮實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基[13]；產(chǎn)鐵載體實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基：CAS培養(yǎng)基[14](chrome azurol S assay medium)。

1.2 方法

1.2.1 黃連種子可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的分離純化

取2 g黃連種子用清水洗凈用75%乙醇浸泡30 s，然后用無(wú)菌水清洗2～3次，用2% NaClO溶液處理10 min，再用無(wú)菌水清洗5～8次，取最后一次清洗種子的無(wú)菌水20 μL涂布于培養(yǎng)基上，用于檢測(cè)消毒是否徹底。接種內(nèi)生細(xì)菌采用稀釋涂布平板法，將表面消毒的種子取1 g放入已滅菌的研缽中再加入2 mL無(wú)菌水研磨，在將研磨后的液體稀釋為1×10-1～1×10-7，涂布于LB和R2A培養(yǎng)基上，每種培養(yǎng)基3個(gè)重復(fù)，37 ℃倒置培養(yǎng)48 h。待分離培養(yǎng)基上單菌落長(zhǎng)出后，在相應(yīng)的新鮮平板上進(jìn)行劃線純化，在37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗倒置培養(yǎng)48 h后，選擇單菌落接種到相應(yīng)的斜面培養(yǎng)基中(依次編號(hào)為ZZ-1～ZZ-X)，待菌落長(zhǎng)出后，放置于4 ℃冰箱中保存。

1.2.2 種子內(nèi)生細(xì)菌的16S rRNA鑒定

采用16S rRNA方法對(duì)黃連種子內(nèi)生菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取分離菌株DNA，采用通用引物27F(5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACT-3′)(引物由北京擎科生物有限成都分公司合成)對(duì)提取的內(nèi)生細(xì)菌DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50 μL PCR擴(kuò)增體系：1×TSE101mix 45 μL，上下游引物各2 μL，DNA模板1 μL。PCR擴(kuò)增程序：98 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性3 min，55 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，循環(huán)數(shù)為39次，72 ℃充分延伸5 min，4 ℃停止反應(yīng)。1%的瓊脂凝膠糖電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。將合格的產(chǎn)物送至北京擎科生物有限成都分公司測(cè)序。獲得的序列拼接后再用BLAST軟件在線(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行同源性比對(duì)，確定各分離菌株分類地位。菌株間的進(jìn)化樹(shù)和聚類分析使用建樹(shù)軟件MAGE 7完成，比對(duì)方法clustal W，建樹(shù)方法Maximum Likelihood，設(shè)定bootstrap為1 000。

1.2.3 黃連種子內(nèi)生細(xì)菌功能研究

溶磷功能研究：待測(cè)菌株在LB培養(yǎng)基上活化，取直徑約0.5 cm的菌盤(pán)接種于PVK培養(yǎng)基、NBRIP培養(yǎng)基和植酸鈣培養(yǎng)基上，每株重復(fù)3次，37 ℃培養(yǎng)7 d。觀察有無(wú)溶磷圈產(chǎn)生，以接種直徑約0.5 cm的空白LB培養(yǎng)基為對(duì)照組。

固氮功能研究：待測(cè)菌株在LB培養(yǎng)基上活化，取直徑約0.5 cm的菌盤(pán)接種于Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長(zhǎng)情況和菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，如出現(xiàn)透明圈則該菌株具有固氮能力，以接種直徑約0.5 cm的空白LB培養(yǎng)基為對(duì)照組。

產(chǎn)鐵載體功能研究：待測(cè)菌株在LB培養(yǎng)基上活化，取直徑約0.5 cm的菌盤(pán)接種于CAS培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)7 d，觀察其生長(zhǎng)情況，觀察菌落周圍是否出現(xiàn)黃色圈，如出現(xiàn)黃色圈則該菌株具有產(chǎn)鐵載體功能，以接種直徑約0.5 cm的空白LB培養(yǎng)基為對(duì)照組。

產(chǎn)IAA功能定性測(cè)定：參考Liu等[15]的方法將供試菌株接種于100 mL LB液體培養(yǎng)基(加入0.5 g/L色氨酸)。置于30 ℃搖床，180 r/min 震蕩培養(yǎng)4 d。取菌懸液10 000 r/min離心5 min，取離心后上清液1 mL于10 mL EP管中，同時(shí)加4 mL比色液(30 mL濃H2SO4，1.5 mL 0.5 mol/L FeCl3，50 mL蒸餾水)，標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照在比色液中加入1 mL 50 mg/L的吲哚乙酸標(biāo)準(zhǔn)品，空白對(duì)照加入1 mL LB液體培養(yǎng)基和4 mL比色液。所有EP管于室溫避光放置30 min后觀察，顏色變紅者表示能夠分泌IAA，依據(jù)顏色變化分為深紅、粉紅和微紅及無(wú)顏色變化4個(gè)等級(jí)。

產(chǎn)IAA功能定量測(cè)定：供試菌株培養(yǎng)條件同上。然后將菌懸液10 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL加入4 mL比色液，避光靜置30 min，于530 nm下比色，記錄OD值。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制采用分析純的IAA梯度稀釋制備，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，IAA濃度為橫坐標(biāo)，代入上述樣品OD值，計(jì)算內(nèi)生菌產(chǎn)生IAA的量。

1.2.4 黃連種子內(nèi)生細(xì)菌促生功能的驗(yàn)證

選擇IAA分泌量超過(guò)100 mg/L的細(xì)菌作為實(shí)驗(yàn)菌株，所選菌種接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)24 h。調(diào)節(jié)菌懸液濃度為1×108CFU/mL，種子表面消毒后用菌懸液浸泡1 h，對(duì)照組用無(wú)菌水浸泡1 h，再接種于瓊脂糖培養(yǎng)基上，每個(gè)平板20粒種子，每種細(xì)菌3個(gè)重復(fù)。每3 d觀察一次，記錄種子發(fā)芽(以種子裂口且長(zhǎng)出1 cm的芽為標(biāo)準(zhǔn))情況，連續(xù)觀察15 d。內(nèi)生細(xì)菌對(duì)種子萌發(fā)的影響按以下公式計(jì)算。

發(fā)芽率=

(15 d種子發(fā)芽數(shù)/種子總數(shù))×100%

(1)

發(fā)芽勢(shì)=

(前3 d發(fā)芽種子數(shù)/種子總數(shù))×100%

(2)

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

用Excel 2018軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，用SPSS 26軟件進(jìn)行單因素方差分析比較組間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃連種子內(nèi)生細(xì)菌分離純化及分子生物學(xué)鑒定

從黃連種子中共分離得到細(xì)菌57株(編號(hào)為ZZ-1～ZZ-57)，其中29株可培養(yǎng)菌株(編號(hào)見(jiàn)表1)通過(guò)16S rRNA基因序列比對(duì)成功，分別屬于厚壁菌門、變形菌門和擬桿菌門中的芽孢桿菌屬Bacillus、變桿菌屬M(fèi)etabacillus、賴氨酸芽胞桿菌屬Lysinibacillus、普里斯特氏菌屬Priestia、寡養(yǎng)單胞菌屬Stenotrophomonas、微桿菌屬M(fèi)icrobacterium、無(wú)色桿菌屬Achromobacter、類芽孢桿菌屬Paenibacillus、泛菌屬Pantoea、假芽孢桿菌屬Fictibacillus、歐文氏菌屬Erwinia、黃桿菌屬Flavobacterium、布魯菌屬Brucella。其中分離得到的芽胞桿菌屬和寡養(yǎng)單胞菌屬菌株最多，各占總鑒定菌株的24.14%。

2.2 黃連種子內(nèi)生細(xì)菌功能研究

2.2.1 溶磷特性

對(duì)29株黃連種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行溶磷特性測(cè)定(見(jiàn)表1)，所有菌株在PVK培養(yǎng)基上均無(wú)透明圈形成；在NBRIP培養(yǎng)基上菌株ZZ-24菌落周圍形成透明圈，表明其可降解無(wú)機(jī)磷；菌株ZZ-22和ZZ-24在以植酸鈣為底物的培養(yǎng)基上形成透明圈，表明ZZ-22和ZZ-24具有溶有機(jī)磷能力；ZZ-7等27株細(xì)菌在NBRIP培養(yǎng)基和植酸鈣培養(yǎng)基上均無(wú)溶磷圈形成，說(shuō)明其無(wú)溶磷能力(見(jiàn)圖1)。

圖1 黃連種子內(nèi)生菌溶磷特性(比例尺：1 cm) Fig.1 Phosphorus-dissolving characteristics of endophytic bacteria strains from seeds of C.chinensis (scale:1 cm)注：上排為NBRIP培養(yǎng)基，下排為植酸鈣培養(yǎng)基。Note:The top row is NBRIP medium,the bottom row is calcium-phyticacids medium.

表1 可培養(yǎng)菌株促生長(zhǎng)特征Table 1 Growth-promoting characteristics of cultivable strain

2.2.2 固氮特性

對(duì)29株黃連種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行固氮功能研究(見(jiàn)表1)，結(jié)果顯示有9株內(nèi)生細(xì)菌(ZZ-23、ZZ-26、ZZ-30、ZZ-36、ZZ-37、ZZ-38、ZZ-39、ZZ-44、ZZ-51)在Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基上形成大小不一的透明圈(見(jiàn)圖2)，表明其具有固氮能力；ZZ-11和ZZ-21等20株細(xì)菌在Ashby無(wú)氮培養(yǎng)基無(wú)透明圈形成，則其無(wú)固氮能力。

圖2 黃連種子內(nèi)生菌固氮特性(比例尺：1 cm) Fig.2 Nitrogen-fixing characteristics of endophytic bacteria strains from seeds of C.chinensis (scale:1 cm)

2.2.3 產(chǎn)鐵載體特性

對(duì)29株黃連種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行固氮功能研究(見(jiàn)表1)，結(jié)果顯示菌株ZZ-4、ZZ-22在CAS培養(yǎng)基上出現(xiàn)黃色暈圈，表明ZZ-4和ZZ-22有產(chǎn)鐵載體的作用(見(jiàn)圖3)；ZZ-6等27株細(xì)菌在CAS培養(yǎng)基上未出現(xiàn)黃色暈圈，表明其無(wú)產(chǎn)鐵載體能力。

圖3 黃連種子內(nèi)生菌產(chǎn)鐵載體特性(比例尺：1 cm) Fig.3 Siderophore production by endophytic bacteria strains from seeds of C.chinensis (scale:1 cm)

2.2.4 產(chǎn)IAA特性

對(duì)29株黃連種子內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行IAA測(cè)定(見(jiàn)表1)，菌株ZZ-4、ZZ-6、ZZ-11、ZZ-21、ZZ-24和ZZ-29細(xì)菌菌液和比色液反應(yīng)成不同程度的紅色，說(shuō)明其具有產(chǎn)IAA能力(見(jiàn)圖4)。測(cè)定以上6株細(xì)菌所產(chǎn)IAA含量，其產(chǎn)量分別是66.90、103.25、64.52、166.90、203.57、177.86 mg/L，產(chǎn)量最高的是菌株ZZ-24，最低是菌株ZZ-11，其中菌株ZZ-6、ZZ-21、ZZ-24和ZZ-29的IAA產(chǎn)量超過(guò)100 mg/L。

圖4 黃連內(nèi)生菌產(chǎn)IAA特性 Fig.4 Production of indoleacetic acid by endophytic bacteria strains from seeds of C.chinensis

2.3 功能菌株16S rRNA分析

通過(guò)16S rRNA序列比對(duì)獲取29株黃連種子內(nèi)生細(xì)菌及與其相似性高的同源菌株(見(jiàn)表2)，基于16S rRNA序列構(gòu)建的發(fā)育系統(tǒng)樹(shù)如圖5所示。結(jié)果表明，ZZ-4菌株與Ba.toyonensisstrain FORT 02的序列聚于一支且序列相似性達(dá)100%；ZZ-22菌株與Ba.subtilisstrain GUCC 8聚為一支，相似度為100%；ZZ-24菌株與Pr.megateriumstrain 5A1-13相似度為100%，一般認(rèn)為16S r RNA基因序列相似性≥97%的原核生物為同一個(gè)種[16]，因此，將既能產(chǎn)鐵載體又產(chǎn)IAA的ZZ-4菌株鑒定為Ba.toyonensis；將既具有溶磷功能又產(chǎn)鐵載體的ZZ-22菌株鑒定為Ba.subtilis；將既能溶磷又可分泌IAA的ZZ-24菌株鑒定為Pr.Megaterium。ZZ-21和ZZ-29菌株與A.spaniusstrain F20Cu-1聚于一支且序列相似性都超過(guò)99%，故將具有產(chǎn)IAA能力的ZZ-21和ZZ-29菌株鑒定為A.spanius。ZZ-6菌株與L.fusiformisstrain ZLynn800-25聚為一支，ZZ-11與Me.niabensisstrain LewisBac8聚為一支，相似性分別為99.93%、99.78%，因此將ZZ-6和ZZ-11菌株鑒定為L(zhǎng).fusiformis、Me.niabensis。ZZ-36、ZZ-37、ZZ-38、ZZ-39均被鑒定為S.rhizophila，且都具有固氮能力。菌株ZZ-23、ZZ-26、ZZ-30、ZZ-44、ZZ-51都具有固氮能力分別與Ba.amyloliquefaciensstrain JX-6、Ba.toyonensisstrain WS2-2、Ba.amyloliquefaciensstrain LE7、Br.Thiophenivoransstrain DSM 7216、Er.Billingiaestrain LMG 2613相似度為100%、99.93%、100%、99.92%、99.86%，其被鑒定為：Ba.amyloliquefaciens、Ba.toyonensis、Ba.amyloliquefaciens、Br.thiophenivoran、Er.Billingiae。

圖5 16S rRNA系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.5 Phylogentic tree based on 16S rRNA

表2 內(nèi)生細(xì)菌16S rRNA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果Table 2 Comparison of 16S rRNA gene sequence of endophytic bacteria with NCBI

續(xù)表2(Continued Tab.2)

2.4 產(chǎn)IAA內(nèi)生細(xì)菌促生長(zhǎng)功能驗(yàn)證

為驗(yàn)證產(chǎn)IAA內(nèi)生菌的促生長(zhǎng)功能，用IAA產(chǎn)量超過(guò)100 mg/L的內(nèi)生細(xì)菌(ZZ-6、ZZ-21、ZZ-24、ZZ-29)菌液處理黃連種子，結(jié)果見(jiàn)表3，其中ZZ-24和ZZ-29菌株對(duì)發(fā)芽率有顯著促進(jìn)作用，與對(duì)照組相比分別提高13.34%和10%。ZZ-24和ZZ-29對(duì)種子的發(fā)芽勢(shì)有較顯著的影響，菌株ZZ-6和ZZ-21與對(duì)照組相比無(wú)顯著影響。

表3 不同內(nèi)生細(xì)菌對(duì)種子萌發(fā)的影響Table 3 Effects of different endophytic bacteria on seed germination

3 討論與結(jié)論

Truyens等[2]發(fā)現(xiàn)在不同植物的種子中芽孢桿菌屬和假單孢桿菌屬為優(yōu)勢(shì)類群，同時(shí)類芽孢桿菌屬、微球菌屬、葡萄球菌屬、泛菌屬和不動(dòng)桿菌屬在種子內(nèi)生菌中也十分常見(jiàn)。本研究以黃連種子為對(duì)象，共分離鑒定出29株分布于13個(gè)屬的內(nèi)生細(xì)菌，其中優(yōu)勢(shì)菌為芽孢桿菌屬和寡養(yǎng)假單孢桿菌屬。促生特性研究表明黃連種子內(nèi)生菌具有產(chǎn)IAA、溶磷、固氮和產(chǎn)鐵載體的功能，其中部分內(nèi)生細(xì)菌同時(shí)具有多種促生功能，如Ba.toyonensisZZ-4能產(chǎn)IAA和鐵載體，Pr.megateriumZZ-24能產(chǎn)IAA并具有溶磷功能。種子萌發(fā)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證具有促生功能的黃連種子內(nèi)生細(xì)菌多分布于芽孢桿菌屬。Gagne-Bourgue等[17]的研究結(jié)果表明芽胞桿菌具有產(chǎn)IAA、細(xì)胞分裂素和溶磷特性，Lu等[18]測(cè)定出亳菊中的巨大芽孢桿菌BN7能夠解磷、解鉀和產(chǎn)IAA。因此，芽孢桿菌屬可能在黃連種子后熟和萌發(fā)過(guò)程中發(fā)揮重要作用，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有較大的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

磷在土壤中大致以不溶性的無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷形式存在，僅小部分磷溶于土壤中可以被植物吸收利用[19]，植物中具有溶磷能力的內(nèi)生菌可將難以被植物吸收的磷轉(zhuǎn)為易吸收的形式，從而促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育[20]。Xie等[21]從植物根際土中分離得到的PseudomonasbrassicacearumH9 具有較高解磷活性的細(xì)菌，其菌懸液對(duì)小麥種子和黃瓜種子的萌發(fā)具有顯著促進(jìn)作用。此外，種子萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)受IAA的調(diào)控，適量的外源IAA可以促進(jìn)種子萌發(fā)和植物根部發(fā)育[22]；Xu等[23]從番茄種子和水稻種子中分離出3株能產(chǎn)IAA的內(nèi)生細(xì)菌，其在番茄、水稻、油菜和蘿卜等植物的根、莖、葉中定殖，并對(duì)幼苗有不同程度的促生長(zhǎng)作用。Khalaf等[24]從瓜類種子中得到56株可以分泌生長(zhǎng)素的內(nèi)生細(xì)菌，其中芽孢桿菌屬和腸桿菌屬為優(yōu)勢(shì)屬。田菁種子中可產(chǎn)生生長(zhǎng)素內(nèi)生細(xì)菌的IAA分泌量范圍是1.29 ～25.47 mg/L，Ba.velezensisSC60 IAA產(chǎn)量最高，且顯著促進(jìn)胚根發(fā)育和提高種子活力[25]。本實(shí)驗(yàn)獲得6株可分泌IAA的內(nèi)生細(xì)菌，其中ZZ-6、ZZ-21、ZZ-24、ZZ-29分泌量超過(guò)100 mg/L，且既能溶磷又高產(chǎn)IAA的Pr.megateriumZZ-24對(duì)黃連種子的促生效果顯著。進(jìn)一步的種子內(nèi)生菌多種促生特性的探索和多功能內(nèi)生菌的挖掘有助于解析內(nèi)生菌在種子發(fā)育與萌發(fā)過(guò)程中的作用機(jī)制。

黃連種子中存在多種促生內(nèi)生細(xì)菌，優(yōu)勢(shì)菌多分布于芽孢桿菌屬，既能溶磷又高產(chǎn)IAA的Pr.megateriumZZ-24對(duì)黃連種子有較好的促生能力，表明其具有潛在的研究和開(kāi)發(fā)利用潛力。具有多種促生能力的內(nèi)生菌可能在黃連種子長(zhǎng)時(shí)間的后熟過(guò)程中發(fā)揮作用，可能是黃連種子能夠完成后熟并成功萌發(fā)的重要因素。