乳腺癌前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關系及意義

馬友龍，張 敏

腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)是評估乳腺癌預后、制定治療方案的重要參考[1]。腋窩前哨淋巴結(jié)活檢已替代腋窩淋巴結(jié)清掃成為前哨淋巴結(jié)陰性患者腋窩根治性手術(shù)的主要方式，是乳腺外科領域里程碑式的進展；當前哨淋巴結(jié)陽性時，推薦行腋窩淋巴結(jié)清掃，不僅能達到良好的治療效果，還能避免過度治療或治療不足，故準確評估腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)意義重大[2-3]。對于早期浸潤性乳腺癌，即使患者臨床特征相似，其前哨淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(SLNM)情況仍不盡相同，提示某些潛在的機制影響了SLNM與否，而目前臨床對此了解有限，所以有必要進一步研究，以闡明其機制。八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-4(Oct-4)定位于6號染色體的短臂21位，可通過結(jié)合DNA上靶序列行使其功能，在體外乳腺癌細胞中Oct-4表達升高，并能促進乳腺癌干細胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移，高表達的Oct-4與患者不良預后密切相關[4]。血管內(nèi)皮生長因子-D(VEGF-D)是促血管新生因子之一，高水平VEGF-D能促進膀胱癌等癌癥淋巴管生成和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，成為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的一個主要途徑[5]。L-選擇素(L-selectin)可結(jié)合特定糖基，是黏附分子選擇素家族成員，在肺癌中表達升高，與無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者相比，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者L-selectin表達進一步升高[6-7]。本研究探討乳腺癌前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與SLNM的關系及意義，以期為深入認識并準確評估SLNM提供參考。

1 資料與方法

1.1納入與排除標準 ①納入標準：符合乳腺癌診斷標準[8]；早期浸潤性乳腺癌；無相關治療史。②排除標準：示蹤劑過敏；炎性乳腺癌；經(jīng)穿刺活檢明確存在腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，未經(jīng)新輔助化療直接手術(shù)；不能耐受腋窩前哨淋巴結(jié)活檢；認知、意識等異常，不能配合本研究。

1.2一般資料 選取2020年4月—2022年7月我院收治的147例乳腺癌為研究對象，采用腋窩前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)判斷SLNM。將無轉(zhuǎn)移及孤立的腫瘤細胞群定義為無SLNM，微轉(zhuǎn)移、宏轉(zhuǎn)移定義為SLNM；其中無轉(zhuǎn)移為切片中未找到腫瘤細胞；孤立的腫瘤細胞群為腫瘤細胞散在單個或腫瘤沉積灶最大徑≤0.2 mm；1個淋巴結(jié)切面上腫瘤細胞≤200個，分期為pN0期；微轉(zhuǎn)移為1個淋巴結(jié)切面上>200個腫瘤細胞或腫瘤沉積灶最大徑0.2～2.0 mm，分期為pN1期；宏轉(zhuǎn)移為分期pN1期及以上，腫瘤沉積灶最大徑>2.0 mm[9]。根據(jù)SLNM情況分為SLNM組67例及無SLNM組80例。SLNM組中58例進行了腋窩淋巴結(jié)清掃，術(shù)中病理學診斷結(jié)果提示SLNM，9例根據(jù)前哨淋巴結(jié)陽性枚數(shù)及綜合治療方案判定，未行腋窩淋巴結(jié)清掃；無SLNM組均未行腋窩淋巴結(jié)清掃。本研究遵循《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》要求。

1.3方法

1.3.1資料收集：采用一般資料調(diào)查表收集患者體質(zhì)量指數(shù)、年齡、絕經(jīng)情況、T分期、腫瘤直徑、區(qū)域淋巴結(jié)分期、患病側(cè)別、腫瘤位置，其中T分期、區(qū)域淋巴結(jié)分期參考第8版美國癌癥聯(lián)合委員會乳腺癌分期。

1.3.2主要試劑與儀器：聚丙烯酰胺凝膠電泳試劑(美國santasanta公司，貨號2016002#)；勻漿緩沖液(美國santasanta公司，貨號2018139#)；轉(zhuǎn)膜緩沖液(英國IAbcam公司，貨號7190051#)；考馬斯亮藍膜染色液(加拿大Fermentas公司，貨號3065812#)；DAB顯色液(加拿大Fermentas公司，貨號2018924#)；一抗、二抗(加拿大Fermentas公司，貨號2015418#、2015437#)；電泳儀(美國伯樂公司)；雙色紅外激光成像系統(tǒng)(美國LI-COR公司Odyssey型)；低溫冷凍離心機(德國艾本德股份公司)；多功能酶標儀(美國MD公司FLEXSTATION 3型)。

1.3.3指標檢測：通過腋窩前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)獲取前哨淋巴結(jié)標本，采用免疫蛋白印跡法檢測前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平，使用組織剪刀將標本剪碎，置于勻漿器中，加入裂解液勻漿，冰上裂解。取出預先準備好的聚丙烯酰胺凝膠，裝好電泳槽，加電泳液，5 min內(nèi)完成上樣，立即電泳，轉(zhuǎn)膜，考馬斯亮藍染膠，5%脫脂奶常溫封閉2 h，切膜，按照1∶1000的比例加入一抗常溫孵育2 h，洗膜，按照1∶5000的比例加入二抗常溫孵育2 h，洗膜，曝光顯影，Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平以內(nèi)參的相對表達量表示。

2 結(jié)果

2.1人口學資料與臨床特征比較 SLNM組在體質(zhì)量指數(shù)、年齡、絕經(jīng)情況、T分期、腫瘤直徑、患病側(cè)別、腫瘤位置方面與無SLNM組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；SLNM組區(qū)域淋巴結(jié)分期與無SLNM組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 2組乳腺癌人口學資料與臨床特征比較

2.2前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平比較 SLNM組前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平高于無SLNM組(P<0.01)。見表2。

表2 2組乳腺癌前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平比較

2.3前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與T分期和區(qū)域淋巴結(jié)分期的關系 隨著T分期和區(qū)域淋巴結(jié)分期升高，前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平逐漸升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3和表4。

2.4多因素Logistic回歸分析 將前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin作為自變量，連續(xù)變量按實際值賦值；將SLNM情況作為因變量，賦值：無SLNM=0，有SLNM=1。分析結(jié)果顯示，前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin均是乳腺癌患者SLNM的獨立危險因素(P<0.01)。見表5。

表3 乳腺癌患者前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與T分期的關系

表4 乳腺癌患者前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平與區(qū)域淋巴結(jié)分期的關系

表5 乳腺癌患者SLNM的多因素Logistic回歸分析

2.5前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin及三者聯(lián)合評估乳腺癌患者SLNM的DCA曲線和CIC分析 繪制前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin評估乳腺癌患者SLNM的DCA曲線，發(fā)現(xiàn)Oct-4、VEGF-D、L-selectin的獲益均高于所有患者不治療(凈獲益為0的全陰性線)以及所有患者接受治療(凈獲益為負值的反斜線)，提示采用Oct-4、VEGF-D、L-selectin評估乳腺癌患者SLNM的臨床效用良好，臨床效用排序：Oct-4、L-selectin、VEGF-D；以相似的方法繪制三者聯(lián)合評估乳腺癌患者SLNM的DCA曲線，發(fā)現(xiàn)三者聯(lián)合較單獨指標評估乳腺癌患者SLNM的臨床獲益度均明顯升高。見圖1。進一步繪制CIC顯示，閾概率值>0.6時，三者聯(lián)合評估乳腺癌患者SLNM與實際情況具有較高的符合率。見圖2。

圖1 前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin及三者聯(lián)合評估乳腺癌患者SLNM的決策曲線分析

圖2 Oct-4、VEGF-D、L-selectin聯(lián)合評估乳腺癌患者SLNM的臨床影響曲線分析

3 討論

Oct-4由C端結(jié)構(gòu)域、N端結(jié)構(gòu)域、POU結(jié)構(gòu)域組成，除結(jié)合DNA外，還能與轉(zhuǎn)錄因子SOX2等形成復合物，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的功能[10-12]。JAHANGIRI等[13]報道，乳腺癌患者Oct-4表達顯著升高。本研究結(jié)果顯示，SLNM組前哨淋巴結(jié)中Oct-4高于無SLNM組，表明與SLNM有關。展暉等[14]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Oct-4的表達能明顯抑制食管癌細胞的活力及侵襲、遷移能力，上調(diào)Oct-4則能促進癌細胞的侵襲與遷移。Oct-4在侵襲性較低的癌細胞中也存在高表達現(xiàn)象，采用基因靶向技術(shù)沉默Oct-4表達，可誘導上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并伴有細胞遷移和浸潤能力的增加，提示Oct-4與癌細胞轉(zhuǎn)移有關[15-16]，與本研究觀點存在相似之處。分析其原因發(fā)現(xiàn)，高表達Oct-4可增強乳腺癌細胞干性，通過影響細胞骨架重組、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、賦予細胞極性等多個途徑，增強乳腺癌細胞的遷移和浸潤能力，從而調(diào)控腫瘤轉(zhuǎn)移[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著T分期和區(qū)域淋巴結(jié)分期升高，前哨淋巴結(jié)中Oct-4水平逐漸升高，與熱孜宛古麗·約麥爾等[18]報道的Oct-4表達與宮頸癌分期呈正相關的結(jié)論相似，表明Oct-4還與腫瘤分期有關。本研究發(fā)現(xiàn)使用前哨淋巴結(jié)中Oct-4評估SLNM時，有良好的正向凈獲益，能為臨床制定后續(xù)的治療方案提供參考。

VEGF-D系血管內(nèi)皮家族成員之一，是該家族中與腫瘤血管和淋巴結(jié)管生成關系最密切的因子[19-21]。SLNM是乳腺癌區(qū)域及遠處淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的“第一站”，作為一種早期事件，其具有重要的預警意義。本研究發(fā)現(xiàn)，存在SLNM患者VEGF-D水平明顯高于無SLNM患者，是乳腺癌患者SLNM的獨立危險因素，具有作為預警標志物的潛在價值。TANIGUCHI等[22]報道，轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌患者VEGF-D高于無轉(zhuǎn)移患者，證實VEGF-D與癌細胞轉(zhuǎn)移有關。VEGF-D促進淋巴管和血管新生的作用，能為乳腺癌SLNM提供有利條件，且在SLNM前即能檢測到顯著高表達的VEGF-D，這意味著早在SLNM前就有新生淋巴管產(chǎn)生，所以檢測前哨淋巴結(jié)中VEGF-D表達，能為早期預測SLNM提供一定參考[23]。本研究后續(xù)分析顯示，VEGF-D評估SLNM均有正向的凈獲益，可作為評估SLNM的標志物。隨著T分期和區(qū)域淋巴結(jié)分期升高，VEGF-D表達逐漸升高，還能為臨床評估乳腺癌分期提供參考信息。

L-selectin擁有類似凝集素樣的細胞外結(jié)構(gòu)，能與細胞表面糖蛋白相互作用，以鈣依賴的方式，介導轉(zhuǎn)移過程中循環(huán)癌細胞與血管、淋巴管的黏附[24-25]。本研究結(jié)果顯示，SLNM組前哨淋巴結(jié)中L-selectin水平高于無SLNM組，表明L-selectin表達具有淋巴結(jié)趨向性特點，可能在促進SLNM中發(fā)揮重要作用，且能作為分子標志物評估乳腺癌SLNM狀態(tài)。現(xiàn)階段L-selectin淋巴結(jié)趨向性表達的機制尚未完全闡明，結(jié)合相關資料分析，外周淋巴結(jié)的高內(nèi)皮微靜脈表面表達L-selectin的其他配體，如硫化糖蛋白，與周圍淋巴結(jié)內(nèi)配體相互作用，促使癌細胞在該位置黏附定植，同時激活細胞內(nèi)鈣動員過程，誘導腫瘤細胞的趨化、黏附，從而調(diào)控SLNM[26-27]。同時本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著T分期和區(qū)域淋巴結(jié)分期升高，前哨淋巴結(jié)中L-selectin水平逐漸升高，提示L-selectin與乳腺癌分期有關。應用L-selectin評估乳腺癌患者SLNM，與Oct-4、VEGF-D一樣，也有正向的凈獲益，但Oct-4、VEGF-D、L-selectin聯(lián)合評估的臨床獲益度高于單獨指標評估，提示三者聯(lián)合評估能提高臨床效用。閾概率值>0.6時，三者聯(lián)合評估乳腺癌患者SLNM與實際情況具有較高的符合率，體現(xiàn)出較高的評價能力，因此建議臨床應聯(lián)合應用進行評估SLNM。

綜上所述，乳腺癌前哨淋巴結(jié)中Oct-4、VEGF-D、L-selectin水平均與SLNM及腫瘤分期有關，是患者發(fā)生SLNM的一個潛在機制，三者聯(lián)合評估SLNM具有良好的臨床獲益度，可作為評估乳腺癌患者SLNM的可靠方法。