利用SSR分子標記鑒定“中絲2號”絲瓜雜交種純度

宋 波，楊 曉，劉高峰，鄭胤建，卞中華，何莉梅，練華山，荊贊革，李清明*，楊其長

（1.中國農業科學院都市農業研究所，四川 成都 611130；2.成都農業科技職業學院農業園藝學院，四川 成都 611130；3.昆明學院農學與生命科學學院，云南 昆明 650217）

“中絲2號”絲瓜是中國農業科學院都市農業研究所培育的長棒型普通絲瓜雜交新品種，具有早熟性好，果實順直且翠綠，果肉不易褐變等優良特性。隨著新品種的推廣和示范，市場反響良好。絲瓜種子質量的好壞取決于雜交制種純度，在制種過程中主要存在母本自交結實造成的生物學混雜問題，進而影響絲瓜雜交種的純度。目前，絲瓜種子純度主要采用常規田間純度鑒定，但這種方法存在鑒定周期長，鑒定效率較低等問題，故篩選建立高效鑒定絲瓜雜交種純度的分子標記，顯得尤為重要。

SSR（Simple Sequence Repeats）分子標記檢測具有可鑒別出雜合子和純合子，特異擴增產物數量豐富，檢測時間短，價格便宜，檢測結果準確，檢測樣品多，在植物的各個生長期均可檢測以及品種純度檢測效率高等優點[1-2]。在瓜類蔬菜種子純度鑒定研究中，SSR分子標記運用比較廣泛，目前在黃瓜[3]、西瓜[4-5]等作物中已取得較好的鑒定效果，鑒定結果與大田種子純度檢測結果吻合率達96%～100%。近年來，絲瓜種子純度鑒定研究也取得了一些進展，朱海生等[6]研究發現，引物SGSSR4在“絲盛2號”雜交種中擴增出含有父、母本遺傳信息的特異互補帶型，利用該引物進行雜交種子純度鑒定結果與大田種植鑒定結果一致；陳曦等[7]利用ISSR分子標記技術對絲瓜雜交種“農福絲瓜801”及其親本的DNA指紋進行分析，篩選出了特異性ISSR引物3個（ISSR-820、ISSR-886和ISSR-891），且能夠運用于“農福絲瓜801”的純度鑒定。本研究以“中絲2號”絲瓜的父母本及其雜種F1代為材料，利用SSR分子標記技術進行雜交種純度的鑒定，以期建立一套室內快速、準確、經濟的絲瓜種子純度鑒定方法，為加速品種的推廣奠定技術基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗于2022年1—6月在中國農業科學院都市農業研究所新津試驗基地進行。供試材料為雜交種（F1）“中絲2號”及其母本（P1）、父本（P2），共3份材料，于2022年1月15日播種，2月20日定植于大棚中。

DNA提取試劑盒，購于上海浦迪生物公司。PCR擴增試劑，購于南京擎科生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取與檢測

在絲瓜3葉期，取F1、P1、P2幼苗第2片真葉提取DNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測絲瓜DNA純度與完整性。具體檢測方法：取1 g瓊脂糖粉，加入100 mL的TAE混合后放入微波爐中加熱3 min，然后加入核酸染料6 μL搖勻，倒入模具中凝固1 h；凝固后上樣品5 μL，電泳20 min，電泳結束后放入凝膠成像系統檢測。

1.2.2 SSR引物篩選

根據劉軍等[8]、朱海生等[9]發表的引物序列進行篩選，由南京一道生物科技有限公司負責引物合成，引物序列見表1。SSR反應體系及參數：反應體系10 μL，上下游引物（濃度10 mmol/μL）各0.5 μL，模板DNA約40 ng，2×TsingKe Mix 4 μL，用ddH2O補足體積。PCR擴增反應程序為：96 ℃預變性2 min；96 ℃變性10 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共30個循環，72 ℃延伸7 min。擴增結束后，將擴增產物采用5%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。5%聚丙烯酰胺凝膠配制如下：聚丙烯酰胺母液（29∶1），10.8 mL；5×TBE，8.0 mL；10% APS，500 μL；TEMED，20 μL；ddH2O，21.2 mL。配制后倒入玻璃模具中凝固2 h后，放入電泳槽，上樣量3 μL，電泳1 h，電泳后取膠進行染色。染色方法：加入乙醇25 mL、冰乙酸1.25 mL、ddH2O 223.75 mL，固定10 min，然后用蒸餾水沖洗2次；再加入AgNO30.5 g、ddH2O 250 mL，避光銀染15 min后，用蒸餾水沖洗2次；最后加入NaOH 3.75 g、CH2O 2.64 mL、ddH2O 244.53 mL，顯色10 min；染色結束后小心取出，放入X射線膠片觀察燈上進行拍照，仔細觀察膠片，篩選出在雙親中具有差異條帶的引物編號。

表1 24對SSR標記的引物序列

1.2.3 擴大雙親及F1中的引物驗證

為了進一步驗證篩選到的多態性引物，故選取6株父本、6株母本以及4株F1（“中絲2號”），先將引物ZS-SSR24在絲瓜親本間進行了雙親擴大驗證，再驗證F1代的帶型，分析F1是否同時繼承雙親的差異條帶。PCR擴增與電泳分析方法參照1.2.2。

1.2.4 F1群體的SSR純度鑒定

選擇“中絲2號”單株46個，用ZS-SSR24引物進行SSR驗證，若同時擴增出雙親的差異條帶，則確定為F1，若只具有父本或母本單一的帶型，則確定為混入F1里的父本或母本種子。F1純度計算方法：F1純度＝具有互補帶型的單株數/總株數×100%。

1.2.5 田間純度鑒定

對1.2.4中所述“中絲2號”46個單株進行田間F1驗證，于5月下旬果實達到商品成熟后，根據絲瓜雜交種的SSR分子純度鑒定結果，對照取樣編號，逐一對單株的農藝性狀進行觀察記載，調查性狀包括葉色、葉形和果實性狀等，對疑似雜株進行仔細觀察。

2 結果與分析

2.1 DNA提取與檢測

由圖1可知，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的絲瓜DNA，結果顯示帶型一致，無降解現象，無蛋白質和RNA等雜質污染。濃度檢測結果顯示，樣品DNA濃度介于20～100 ng/μL，能滿足后續SSR反應的需求。

圖1 雙親和F1的DNA電泳檢測結果

2.2 引物的篩選

由圖2中24對SSR引物在“中絲2號”雙親中的擴增結果可知，除4條引物（SSR3、SSR5、SSR13和SSR16）不能擴增出條帶外，其余20條引物均能獲得較穩定的擴增圖譜；但在20條引物中，僅有1對引物（ZS-SSR24）能在“中絲2號”父母本之間擴增獲得差異條帶。

圖2 雙親的SSR多態性分析

2.3 擴大雙親及F1中驗證引物準確性

2.3.1 擴大雙親驗證引物準確性

從圖3中可知，在雙親中均擴增出了特異性條帶，說明篩選到的引物在雙親中確實存在多態性，分別在母本和父本中擴增出220 bp和250 bp大小的差異條帶（圖3a）。

2.3.2 雙親和F1驗證引物的準確性

從理論上講，凡是同時具有雙親特異性條帶的就應該是真雜種，反之，就可能是F1中混入了父本或者母本。分別選取雙親和4個F1，利用引物ZS-SSR24進行擴增，在F1中，ZS-SSR24引物在父母本之間分別擴增獲得250 bp和220 bp的差異條帶，全部的F1均繼承雙親的特異性條帶，說明ZS-SSR24引物是1個共顯性標記（圖3b）。

圖3 ZS-SSR24引物在雙親及F1中的擴增結果

2.4 F1群體SSR純度驗證

ZS-SSR24引物擴增結果表明，在46個F1群體中，除了第15、24、29和43泳道僅擴增出母本的特異性條帶，其他F1泳道均擴增出雙親的條帶，故確定上述4個單株是混入F1中的母本種子，純度鑒定結果為91.3%（圖4）。

圖4 ZS-SSR24引物在F1群體中的驗證結果

2.5 F1田間純度鑒定

田間農藝性狀鑒定結果表明，在46份“中絲2號”植株樣本中，2.4中確定的4株均表現出了母本典型性狀（果皮淺綠色、果實較長、葉片大等性狀），可以明顯與父本（短棒型）和“中絲2號”（果實順直，果皮翠綠）區分開來。經計算，這批樣本的純度為91.3%，田間鑒定結果與SSR分子鑒定結果完全吻合。

3 結論與討論

由于絲瓜種瓜成熟時間長，在新疆或甘肅等主要絲瓜制種地區生產的雜交種直到10月初才能陸續收獲。這時四川地區的溫度趨低，通過當地田間栽培進行純度鑒定已不可行，而未經鑒定的雜交種一旦進入市場，會帶來極大的風險。但通過苗期取樣進行SSR分子標記純度鑒定，則大大加速了純度鑒定的進程，保障種子質量達標的新種子能夠順利進入市場銷售。朱海生等[6]研究表明，利用SSR分子標記能夠鑒定絲瓜的純度，但采用的群體相對較小，故需要擴大群體進行驗證，研究結果才更準確。本研究采用相對較大的F1群體進行驗證，結果表明，ZS-SSR24引物在“中絲2號”的擴增結果表現為1個共顯性標記，能夠有效鑒定出混在其中的父本或者母本種子，分子標記結果與田間觀察結果完全吻合，樣本純度均為91.3%，說明ZS-SSR24引物能夠高效鑒定“中絲2號”絲瓜品種的純度。

在絲瓜制種過程中，種子不純的主要原因是母本的雌花接受了自身的花粉，從而得到自交果實，導致母本自交種子與雜交種混在一起，產生假雜種；本研究鑒定出的4個雜株均來自母本自交的種子，說明只要能有效區分F1和母本的SSR標記，就能夠運用于絲瓜雜交種純度的鑒定。