凱氏定氮法檢測乳制品中蛋白質含量的優化方法

黃漫蓉，宋艷梅，范光彩，周 歡，錢成林*，夏忠悅，2

1 新希望乳業股份有限公司，四川成都 610023 2 乳品營養與功能四川省重點試驗室，四川成都 610023

0 引言

蛋白質是乳制品的主要營養成分之一，是衡量乳制品質量的一項重要指標[1，2]。目前檢測乳制品中蛋白質的常見方法有凱氏定氮法、分光光度法、燃燒法、紅外光譜法、雙縮尿法、甲醛滴定法、考馬斯亮藍法、高效液相色譜-質譜聯用法、毛細管電泳法等。但是從檢測結果的準確性、及時性和檢測過程的安全性考慮，分光光度法和甲醛滴定法干擾物質較多，準確性差；燃燒法不能區分蛋白氮和非蛋白氮；紅外光譜法需要定期校準，檢測成分單一；雙縮尿法靈敏度差；精密度差；高效液相色譜-質譜聯用法和毛細管電泳法所需要的檢測儀器操作復雜，需要檢測人員具備一定的專業技能[3～8]。

凱氏定氮法是一種比較常見的檢測方法，與其他方法相比較，凱氏定氮法最適宜用來檢測乳制品中蛋白質含量，檢測結果準確性較高，儀器操作簡單，使用者能快速掌握儀器的使用方法[9，10]。該方法主要步驟在消化和蒸餾，其中消化花費的時間最長，檢測時的樣品稱樣量也各不相同，因此本文主要對凱氏定氮法檢測乳制品蛋白質含量的過程進行優化，以能更好地開展檢測工作。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

澳特蘭純牛奶（滅菌乳）、新希望草莓味奶（調制乳）、悠質原味風味酸奶（發酵乳）、飯后半小時果蔬乳酸菌飲品（乳飲料），新希望乳業股份有限公司。

硫酸（優級純），成都市科隆化學品有限公司；蛋白質催化劑片（硫酸銅+硫酸鉀），福斯華（北京）科技貿易有限公司；0.05 mol/L硫酸標準溶液（SRM），深圳市博林達科技有限公司；硼酸（分析純），成都市科隆化學品有限公司；氫氧化鈉（分析純），成都市科隆化學品有限公司；溴甲酚綠（指示劑），成都市科隆化學品有限公司；甲基紅（指示劑），成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

KjeltecTM 8400全自動凱氏定氮儀、LabtecTM Line 消化爐，福斯華（北京）科貿有限公司；電子天平（感量：0.1 mg），梅特勒-托利多儀器公司；UPR-Ⅱ-20L 純水機，四川優普超純科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑配制

1 g/L溴甲酚綠乙醇溶液：稱取0.1 g溴甲酚綠，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

1 g/L甲基紅乙醇溶液：稱取0.1 g甲基紅，溶于95%乙醇，用95%乙醇稀釋至100 mL。

10 g/L硼酸溶液：稱取10 g硼酸，加超純水溶解并稀釋至1 000 mL，加入7 mL甲基紅乙醇溶液，10 mL溴甲酚綠乙醇溶液混合均勻，取30 mL配制好的硼酸溶液加100 mL純水，顏色呈淺灰色，若偏紅則用0.1 mol/LNaOH調節，若偏綠則用0.1 mol/L的HCl調節。

400 g/L氫氧化鈉溶液：稱取400 g固體氫氧化鈉，加水溶解后放冷，并稀釋至1 000 mL。

1.3.2 樣品檢測

稱取混合均勻的一定量樣品（精確至0.000 1 g）至250 mL消化管中，放入1 粒蛋白質催化劑，加入12 mL濃硫酸，混勻后于消化爐上消化，設置消化時間及消化溫度，待消化結束時消化管中的液體呈綠色透明狀，取出待冷卻至室溫，于全自動凱氏定氮儀上實現自動加液、蒸餾、滴定和記錄滴定數據的過程[11]。

1.3.3 蒸餾條件

使用全自動凱氏定氮儀，蒸餾條件設置為：稀釋液（超純水）70 mL、堿液（400 g/L氫氧化鈉溶液）60 mL、接收液（10 g/L硼酸溶液）30 mL。

1.3.4 優化方案

（1）分別稱取滅菌乳、調制乳、發酵乳、乳飲料各1 g、2 g、3 g、4 g、5 g，試樣在相同條件消化蒸餾，比對不同的稱樣量對檢測結果的影響。

（2）稱取同一質量的滅菌乳、調制乳、發酵乳、乳飲料，比對不同的消化時間（40 min、60 min、80 min、100 min、150 min）對檢測結果的影響。

（3）消化后的樣品及時冷卻一段時間后再使用凱氏定氮儀蒸餾滴定，比對不同的冷卻時間（0.5 h、4 h、24 h、48 h）對檢測結果的影響。

2 結果與分析

2.1 稱樣量優化

稱取滅菌乳、發酵乳、調制乳、乳飲料不同的稱樣量進行平行試驗，結果如表1所示，對于混合均勻的乳制品，一定范圍內稱樣量對結果的影響不大，精密度均符合《GB 5009.5—2016 食品安全國家標準 食品中蛋白質的測定》的要求，但是滅菌乳、調制乳、飲料稱樣量增多，精密度對應越好，發酵乳則稱樣量過多后精密度有所下降。

表1 滅菌乳不同稱樣量測定結果

2.2 消化時間優化

分別稱取滅菌乳、發酵乳、調制乳、乳飲料5 g，每個樣品進行4 平行試驗，先在230 ℃消化30 min，后420 ℃消化。根據牛奶蛋白質檢測結果綜合分析，在420 ℃時消化80 min，可消化完全，精密度可以控制在1%以內。結果如表2所示。

表2 不同消化時間檢測結果

2.3 冷卻時間優化

分別稱取滅菌乳、發酵乳、調制乳、乳飲料，每個樣品進行2 平行試驗，一起消化后冷卻不同的時間后，再使用凱氏定氮儀進行蒸餾滴定，結果如表3所示，48 h內，檢測結果沒有顯著差異。所以在消化結束后可以根據試驗者安排，合理規劃后續試驗時間，不用必須接著進行蒸餾滴定操作。

表3 消化后樣品冷卻不同時間的蛋白質檢測結果

3 結論

本試驗在采用國標方法的基礎上使用凱氏定氮法檢測牛奶中蛋白質含量，對于混合均勻的樣品，不同的稱樣量對檢測結果影響不大，樣品在230 ℃消化30 min后繼續在420 ℃消化80 min，能消化完全且精密度好；消化后樣品的冷卻時間不影響其檢測結果。