子宮肌瘤組織中miR-23、HIF-1α表達(dá)水平及其與細(xì)胞侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的相關(guān)性

曹 偉

江西省南昌市南昌縣人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，江西南昌 330200

子宮肌瘤是育齡期女性最常見的良性腫瘤，且近年來其發(fā)病率逐年升高，發(fā)病人群趨于年輕化[1]。目前認(rèn)為子宮肌瘤是一種雌激素依賴性腫瘤，雌激素水平過高可刺激細(xì)胞增殖、侵襲，但相關(guān)機(jī)制仍未完全明確[2]。低氧是實(shí)體腫瘤生存的微環(huán)境所具有的特征，而低氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)是引起細(xì)胞低氧反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，可能參與子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展[3]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼RNA，調(diào)控細(xì)胞生長、增殖、凋亡等各種生理過程。研究表明，多種miRNA參與子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程[4]。miR-23是目前研究者們關(guān)注的焦點(diǎn)，研究顯示，子宮肌瘤組織中miR-23呈低表達(dá)，可能參與子宮肌瘤的發(fā)生，但相關(guān)機(jī)制尚未完成明確[5]。基于此，本研究探討了子宮肌瘤組織中miR-23、HIF-1α的表達(dá)水平及其與細(xì)胞侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)的相關(guān)性，旨在為子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制研究提供參考，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2021年1月至2022年1月于本院行手術(shù)切除治療的子宮肌瘤患者84例為研究對(duì)象，收集其切除的子宮肌瘤組織和正常肌層組織進(jìn)行研究。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)術(shù)后病理檢查證實(shí)為子宮肌瘤；增生期患者，月經(jīng)周期規(guī)律。排除標(biāo)準(zhǔn)：術(shù)前3個(gè)月使用過激素類藥物；合并甲狀腺功能減退或亢進(jìn)癥、糖尿病；合并心、肝、腎功能不全；合并卵巢腫瘤。患者年齡35～54歲，平均(47.28±5.84)歲。

1.2方法 術(shù)中收集子宮肌瘤組織及距子宮肌瘤0.5 cm以上的適量正常肌層組織，于-80 ℃冰箱儲(chǔ)存。(1)miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)進(jìn)行檢測(cè)，取適量標(biāo)本，采用Trizol法提取組織總RNA(試劑盒購自上海名勁生物科技有限公司)，將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR反應(yīng)以U6為內(nèi)參，U6上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物5′-AAC GCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-23上游引物5′-TCACACTATATCACATTGCCAGG-3，下游引物5′-TATGGTTGTTCTGCTCTCTGTCTC-3′；HIF-1α mRNA上游引物5′-ATCCATGTGACCATGAGGAAATG-3′，下游引物5′-TCGGCTAGTTAGGGTACACTTC-3′，結(jié)果采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。(2)雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)表達(dá)情況檢測(cè)。組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋切片，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)ER、PR表達(dá)情況，采用Sinicrope改良法進(jìn)行結(jié)果判斷，表達(dá)評(píng)分=染色細(xì)胞計(jì)數(shù)評(píng)分×染色強(qiáng)度評(píng)分，陰性：表達(dá)評(píng)分≤1分；弱陽性：表達(dá)評(píng)分2～3分；中度陽性：表達(dá)評(píng)分4～5分；強(qiáng)陽性：表達(dá)評(píng)分≥6分。(3)增殖基因、凋亡基因、侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平檢測(cè)。取適量標(biāo)本，提取組織總蛋白，采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)試劑盒檢測(cè)增殖基因[B淋巴細(xì)胞瘤-2(Bcl-2)]、凋亡基因[Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)]、侵襲基因[基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)2、MMP9]、EMT標(biāo)志基因[N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)]表達(dá)水平，將每毫克總蛋白中上述基因蛋白層面的表達(dá)水平作為其表達(dá)水平。

1.3觀察指標(biāo) (1)比較子宮肌瘤組織及正常肌層組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平及ER、PR陽性率。(2)比較不同ER、PR表達(dá)情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平。(3)比較子宮肌瘤組織及正常肌層組織增殖、凋亡基因表達(dá)水平。(4)分析子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與增殖、凋亡基因表達(dá)水平的相關(guān)性。(5)比較子宮肌瘤組織及正常肌層組織侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平。(6)分析子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平的相關(guān)性。

2 結(jié) 果

2.1子宮肌瘤組織與正常肌層組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平及ER、PR陽性率比較 子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平低于正常肌層組織，HIF-1α mRNA表達(dá)水平及ER、PR陽性率高于正常肌層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 子宮肌瘤組織及正常肌層組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平及ER、PR陽性率比較

2.2不同ER、PR表達(dá)情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較 ER、PR陽性子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平分別低于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，HIF-1α mRNA表達(dá)水平分別高于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2、3。

表2 不同ER表達(dá)情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1αmRNA表達(dá)水平比較

表3 不同PR表達(dá)情況子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平比較

2.3子宮肌瘤組織與正常肌層組織增殖、凋亡基因表達(dá)水平比較 子宮肌瘤組織Bcl-2表達(dá)水平高于正常肌層組織，Bax表達(dá)水平低于正常肌層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表4 子宮肌瘤組織與正常肌層組織增殖、凋亡基因表達(dá)水平比較

2.4子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與增殖、凋亡基因表達(dá)水平的相關(guān)性 子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平與Bcl-2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Bax表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；子宮肌瘤組織HIF-1α mRNA表達(dá)水平與Bcl-2表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與Bax表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表5。

表5 子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與增殖、凋亡基因表達(dá)水平的相關(guān)性

2.5子宮肌瘤組織與正常肌層組織侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平比較 子宮肌瘤組織MMP2、MMP9、N-cadherin表達(dá)水平高于正常肌層組織，E-cadherin表達(dá)水平低于正常肌層組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表6。

表6 子宮肌瘤組織與正常肌層組織侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平比較

2.6子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平的相關(guān)性 子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與E-cadherin表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；子宮肌瘤組織HIF-1α mRNA表達(dá)水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，見表7。

表7 子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與侵襲基因、EMT標(biāo)志基因表達(dá)水平的相關(guān)性

3 討 論

子宮肌瘤可引起月經(jīng)周期紊亂、痛經(jīng)、盆腔壓迫癥狀及生育能力低下，極大危害女性生殖健康和生活質(zhì)量[6]。子宮肌瘤屬于激素依賴性腫瘤，但至今其確切發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。因此，積極探索子宮肌瘤的發(fā)病機(jī)制，尋找有效的治療靶點(diǎn)具有重要的臨床價(jià)值。

miRNA屬于非編碼小RNA，通過結(jié)合下游靶基因使其沉默，進(jìn)而在轉(zhuǎn)錄后精密調(diào)控下游靶蛋白。本研究利用RT-qPCR檢測(cè)子宮肌瘤組織及正常肌層組織miR-23表達(dá)水平，結(jié)果顯示，子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平明顯低于正常肌層組織，提示miR-23是在子宮肌瘤組織中表達(dá)明顯失調(diào)的miRNA之一，與劉烜等[7]的研究結(jié)果一致。孕激素是誘發(fā)子宮肌瘤的重要內(nèi)分泌因素，孕激素通過特異性結(jié)合PR，激活核內(nèi)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，參與子宮肌瘤的發(fā)生。有學(xué)者用Targetscan軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)，PR基因是miR-23的靶基因之一[8]。且研究顯示，子宮肌瘤組織中miR-23表達(dá)水平與PR亞型蛋白PRA表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[9]，這可能是miR-23參與子宮肌瘤發(fā)生與發(fā)展的重要機(jī)制。在腫瘤組織微環(huán)境中缺氧普遍存在，HIF-1α是HIF-1亞單位，具有氧調(diào)節(jié)作用，在缺氧、炎癥反應(yīng)等情況下，其通過缺氧反應(yīng)元件調(diào)控細(xì)胞凋亡、血管形成等生物學(xué)過程，增強(qiáng)機(jī)體對(duì)刺激的適應(yīng)性[10]。有研究報(bào)道，HIF-1α mRNA在子宮肌瘤患者血清與組織中呈高表達(dá)，可能成為子宮肌瘤的潛在標(biāo)志物[11-12]。本研究也發(fā)現(xiàn)類似結(jié)論，提示在子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展過程中，HIF-1α可能起重要作用。結(jié)合分子生物學(xué)功能，推測(cè)高表達(dá)的HIF-1α可能通過調(diào)控腫瘤血管生成、細(xì)胞凋亡、能量代謝等影響細(xì)胞增殖，進(jìn)而引起子宮肌瘤的發(fā)生。雌、孕激素對(duì)子宮肌瘤生長具有促進(jìn)作用，ER、PR與雌、孕激素親和力高，可選擇性保留較高水平雌、孕激素，加強(qiáng)其生物學(xué)效應(yīng)[13]。本研究進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，ER、PR陽性子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平分別低于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，HIF-1α mRNA表達(dá)水平分別高于ER、PR陰性子宮肌瘤組織，提示子宮肌瘤組織中miR-23、HIF-1α的表達(dá)與ER、PR有關(guān)。進(jìn)一步說明miR-23、HIF-1α在子宮肌瘤發(fā)展中發(fā)揮作用。

多種增殖、凋亡基因在子宮肌瘤細(xì)胞增殖過程中起重要的調(diào)節(jié)作用。Bcl-2可通過線粒體途徑使細(xì)胞生存時(shí)間延長，并增強(qiáng)細(xì)胞耐受外界刺激的能力，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖；Bax與Bcl-2是同源蛋白質(zhì)，二者功能相互拮抗[14]。本研究顯示，子宮肌瘤組織Bcl-2表達(dá)水平高于正常肌層組織，Bax表達(dá)水平低于正常肌層組織，與既往研究結(jié)果一致[15]，提示增殖、凋亡基因異常表達(dá)與子宮肌瘤形成密切相關(guān)。進(jìn)一步分析子宮肌瘤組織miR-23、HIF-1α mRNA表達(dá)水平與上述基因的相關(guān)性發(fā)現(xiàn)，miR-23表達(dá)水平與Bcl-2表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與Bax表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，HIF-1α mRNA表達(dá)水平與Bcl-2表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)，與Bax表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。因此，推測(cè)子宮肌瘤組織miR-23低表達(dá)、HIF-1α mRNA高表達(dá)可能通過促進(jìn)增殖基因表達(dá)、抑制凋亡基因表達(dá)而參與子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展。

子宮肌瘤細(xì)胞侵襲性生長是引起子宮肌瘤病灶生長的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[16]。MMP是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解與重構(gòu)的主要酶類，其中MMP2、MMP9是降解Ⅳ型膠原酶的主要酶[17]。同時(shí)，細(xì)胞侵襲性生長還與EMT有關(guān)。EMT形成過程中，細(xì)胞由上皮表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型，細(xì)胞間極性降低，且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)特性增強(qiáng)，利于細(xì)胞侵襲[18]。N-cadherin、E-cadherin分別是間質(zhì)表型、上皮表型細(xì)胞標(biāo)志分子，與EMT密切相關(guān)[19]。本研究顯示，子宮肌瘤組織MMP2、MMP9、N-cadherin表達(dá)水平高于正常肌層組織，E-cadherin表達(dá)水平低于正常肌層組織，提示MMP高表達(dá)及EMT加劇與子宮肌瘤發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤組織miR-23表達(dá)水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與E-cadherin表達(dá)水平呈正相關(guān)(P<0.05)；HIF-1α mRNA表達(dá)水平與MMP2、MMP9、N-cadherin表達(dá)水平呈正相關(guān)，與E-cadherin表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，說明子宮肌瘤組織miR-23低表達(dá)、HIF-1α mRNA高表達(dá)可促進(jìn)MMP表達(dá)及EMT，促進(jìn)細(xì)胞侵襲。

綜上所述，miR-23低表達(dá)、HIF-1α高表達(dá)可能通過促進(jìn)ER、PR高表達(dá)，細(xì)胞增殖、侵襲及EMT參與子宮肌瘤發(fā)生與發(fā)展。但miR-23、HIF-1α參與子宮肌瘤發(fā)生、發(fā)展的機(jī)制尚未完全闡明，如何相互促進(jìn)、何為始發(fā)因素等問題仍有待后續(xù)研究進(jìn)一步明確。