肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與其對抗菌藥物敏感性的關系分析*

朱昱蓉，黃 晶，趙 君，江水明，劉榮華

山西省臨汾市中心醫院微生物實驗室,山西臨汾 041000

肺炎克雷伯菌是一種有莢膜的革蘭陰性粗短桿菌，屬于ESKAPE(包括革蘭陽性腸球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌、綠膿桿菌、腸桿菌)病原體的一員[1]。臨床上肺炎克雷伯菌因高耐藥率及高播散性成為引起院內外感染的重要病原菌[2]，2020年全國細菌耐藥監測報告顯示，分離的革蘭陰性菌中，肺炎克雷伯菌占比(占革蘭陰性菌的20.9%)僅次于大腸埃希菌(占革蘭陰性菌的29.7%)，位居革蘭陰性菌的第2位[3]。在國內，肺炎克雷伯菌感染所致肺炎占呼吸機相關肺炎和重癥監護病房獲得性肺炎的11.9%[4]。生物膜是細菌的一種保護機制，研究表明，肺炎克雷伯菌可聚集于導管或內置醫療器械表面形成黏稠的生物膜結構，常規清洗難以去除[5]。成熟的生物膜可保護細菌免受機體免疫系統殺傷，導致細菌對常規抗菌藥物抗性增加1 000倍左右，可引起免疫受損者持續發生醫院感染或難治性導管相關感染，大大增加了感染的難治程度。研究發現，肺炎克雷伯菌臨床分離株生物膜形成率高達60%[6-7]。生物膜作為細菌耐藥的一種重要機制，但目前其形成能力與肺炎克雷伯菌對抗菌藥物敏感性關系的相關研究較少。因此，本研究選取住院患者送檢標本中分離培養并鑒定的肺炎克雷伯菌菌株為研究對象，探究肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與其對抗菌藥物敏感性的關系，以期為醫院感染的控制和用藥指導提供理論依據。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2021-2022年本院住院患者送檢標本中分離出的肺炎克雷伯菌菌株，剔除同一患者的重復菌株，采用紙片法將菌株保存于-80 ℃冰箱。質控菌株為肺炎克雷伯菌ATCC700603，購自山西省臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 血平板購自鄭州人福博賽生物技術有限責任公司；LB液體培養基購自北京索萊寶科技有限公司；結晶紫染液購自珠海貝索生物技術有限公司；96孔細胞培養板購自美國Corning公司；藥敏卡購自法國生物梅里埃公司；MH 瓊脂粉購自杭州濱河微生物試劑有限公司；藥敏紙片購自英國 Oxoid公司；一次性比濁管購自法國生物梅里埃公司。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀購自江蘇天瑞儀器股份有限公司；比濁儀、VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統購自法國生物梅里埃公司；VARIOSKAN LUX酶標儀、CO2培養箱購自美國賽默飛世爾公司。

1.3方法

1.3.1菌株鑒定及藥敏試驗 參照美國臨床和實驗室標準化協會(CLSI)2019相關標準，用傳統方法培養、分離、純化細菌，通過基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀進行菌株鑒定，采用VITEK-2 Compact全自動微生物鑒定及藥敏分析系統聯合紙片擴散(K-B)法分析菌株對抗菌藥物的敏感性，采用雙紙片協同擴散法檢測菌株產超廣譜β-內酰胺酶(ESBL)情況，具體操作細節和結果判讀參照CLSI 2019相關標準進行。

1.3.2菌株生物膜形成能力檢測 凍存菌株在血平板上復蘇，培養16～18 h后用無菌棉簽挑取3個單克隆菌落制備0.5麥氏濁度菌懸液，將200 μL LB液體培養基和20 μL 0.5麥氏濁度的菌懸液(陰性對照加入20 μL LB液體培養基，陽性對照為ATCC700603)接種于96孔細胞培養板中，96孔細胞培養板周圍加入生理鹽水保持濕度。將培養板置于35 ℃含5%CO2的培養箱中靜置培養30 h；棄去LB液體培養基，并用滅菌雙蒸水清洗3次，棄去游離細菌，隨后加入甲醇固定10 min；每孔加入300 μL 1%結晶紫染液染色2 min，滅菌雙蒸水清洗3次去除未結合染液；控干水分后每孔加入200 μL 95%乙醇充分溶解結晶紫染液，讀取570 nm處吸光度值[1]。以吸光度值(陰性對照的平均吸光度值+3×標準差值)為臨界值，大于該吸光度值則判定為形成生物膜。

1.3.3資料收集 收集檢出菌株患者的臨床資料，包括年齡、性別、標本類型、標本來源科室、侵入性操作情況等。侵入性操作是醫療過程中帶有一定創傷性的檢查或治療措施，主要包括動靜脈置管、呼吸機應用、留置導尿管或胃管、手術治療、內窺鏡檢查、氣管插管/切開、血液透析、CT/超聲引導下穿刺、引流等。

2 結 果

2.1菌株臨床特征 2021-2022年共收集肺炎克雷伯菌143株，其中耐碳青霉烯類肺炎克雷伯菌(CRKP)1株，產ESBL菌株14株。143例患者平均年齡為(58.97±20.52)歲，其中女41例(28.67%)，男102例(71.33%)，男性占比高于女性，差異有統計學意義(P<0.05)。臨床分離的菌株標本類型以痰液(84.62%)為主，在尿液、肺泡灌洗液、分泌物、全血、胸腔積液及其他標本中均有檢出，但占比均低于10%。分離出肺炎克雷伯菌的科室中，以重癥醫學科(27.27%)和呼吸危重癥科(26.57%)分離的菌株占比較高。31.47%的菌株來源患者進行了支架置入、腦血管造影等手術治療。見表1。

表1 肺炎克雷伯菌臨床分布情況

續表1 肺炎克雷伯菌臨床分布情況

2.2菌株藥敏試驗結果 肺炎克雷伯菌對抗菌藥物敏感性較高，檢測的抗菌藥物敏感率均>60%，1株CRKP對亞胺培南不敏感，14株產ESBL菌株均對第四代頭孢菌素表現出不同程度耐藥。對美羅培南敏感率最高(100.00%)，其次為亞胺培南(99.30%)。檢測的3種氨基糖苷類抗菌藥物中，肺炎克雷伯菌對丁胺卡那霉素的敏感率最高(97.20%)。肺炎克雷伯菌對第一代頭孢菌素頭孢唑林的敏感率為64.34%，對第二代頭孢菌素頭孢呋辛的敏感率為81.12%，對第三代頭孢菌素頭孢曲松(86.01%)、頭孢他啶(92.31%)的敏感率較高。對氟喹諾酮類抗菌藥物左氧氟沙星(88.11%)和環丙沙星(86.01%)敏感率均>85%。見表2。

表2 肺炎克雷伯菌藥敏試驗結果

2.3菌株生物膜形成能力檢測結果 對吸光度值數據分析顯示，在收集的143株菌株中，有111株可形成生物膜，32株無生物膜形成，生物膜形成率達77.62%。

2.4生物膜形成能力與對抗菌藥物敏感性分析 111株生物膜形成菌株和32株無生物膜形成菌株藥敏試驗結果表明，生物膜形成菌株對頭孢曲松、頭孢吡肟和頭孢呋辛的不敏感率與無生物膜形成菌株比較，差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與對抗菌藥物敏感性分析結果

續表3 肺炎克雷伯菌生物膜形成能力與對抗菌藥物敏感性分析結果

2.5產ESBL菌株與生物膜形成能力的關系 產ESBL菌株生物膜形成率達85.71%(12/14)，非產ESBL菌株生物膜形成率為76.74%(99/129)，二者生物膜形成率比較，差異無統計學意義(χ2=0.585，P=0.444)。

2.6重癥醫學科、呼吸危重癥科和其余科室分離的肺炎克雷伯菌對抗菌藥物敏感性的差異分析 對抗菌藥物敏感性分析表明，醫院其余科室分離的肺炎克雷伯菌與重癥醫學科和呼吸危重癥科分離的肺炎克雷伯菌對所檢測抗菌藥物的不敏感率比較，差異無統計學意義(P>0.05)。重癥醫學科分離的肺炎克雷伯菌對復合制劑(哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦 )和米諾環素的不敏感率低于呼吸危重癥科分離的肺炎克雷伯菌，差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表4 重癥醫學科、呼吸危重癥科和其余科室分離的肺炎克雷伯菌對抗菌藥物敏感性分析結果

2.7重癥醫學科、呼吸危重癥科和其余科室分離的肺炎克雷伯菌產ESBL和生物膜形成能力分析 重癥醫學科、呼吸危重癥科和其余科室產ESBL肺炎克雷伯菌分別占7.69%、5.26%和13.64%，產ESBL菌株占比在上述科室間比較，差異無統計學意義(P>0.05)。重癥醫學科、呼吸危重癥科和其余科室分離的肺炎克雷伯菌中有生物膜形成的菌株分別占79.49%、73.68%和78.79%，上述科室中有生物膜形成的菌株占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

3 討 論

肺炎克雷伯菌是臨床常見致病菌，分離率約占克雷伯氏菌屬的95%，是耐藥和毒力基因在革蘭陰性菌與環境之間傳播的媒介，可導致醫院感染或社區感染的發生，嚴重威脅患者健康[8]。在抗菌藥物的選擇壓力下出現了產ESBL肺炎克雷伯菌和CRKP[9]。全國細菌耐藥檢測報告顯示，肺炎克雷伯菌分離率占全部菌株的13%～14%，且對抗菌藥物敏感性較高，CRKP檢出率也呈上升趨勢[3]。肺炎克雷伯菌多造成呼吸系統感染，在呼吸機相關肺炎中常見，吸煙、飲酒及呼吸系統基礎疾病(如慢性阻塞性肺疾病等)均為其感染的危險因素[10]。本研究結果表明，肺炎克雷伯菌感染患者中男性多于女性，這可能與本研究入組患者中男性吸煙、飲酒的比例較高相關。菌株對抗菌藥物敏感性分析發現，分離的肺炎克雷伯菌對檢測的抗菌藥物敏感率較高，均>60%，與全國細菌耐藥監測報告結果基本一致[3]。本研究結果表明，重癥醫學科來源的菌株對抗菌藥物敏感性整體較呼吸危重癥科高，這可能與不同科室間治療藥物使用及患者基礎狀況不同有關，有待深入探究。全國細菌耐藥監測報告顯示，我國CRKP檢出率呈逐年上升趨勢，而本研究僅檢出1株CRKP，這可能與本院感染防控工作開展效果較好和耐藥菌株在全國的地域分布差異有關。

隨著細菌耐藥情況的加劇，對菌株耐藥機制的研究也逐步深入，目前已知的細菌耐藥機制包括耐藥基因的攜帶、菌株外膜蛋白、菌株外排泵、整合子基因盒和菌株生物膜形成等[5]。隨著對細菌生物膜相關研究的深入，研究者發現生物膜形成能力與菌株耐藥性密切相關，菌株生物膜形成嚴重影響臨床抗感染治療的效果及患者預后[11]。細菌生物膜是細菌在營養等條件不足的情況下形成的一種黏附在物體表面或氣液交界面的膜性結構，內部包裹著大量菌落，是細菌的天然保護屏障，在細菌存活、菌株間信息交流、細菌免疫及對抗菌藥物不敏感方面發揮著重要的作用，是引起臨床難治性感染的主要因素[12]。目前的研究表明，細菌生物膜形成主要分為3個階段，第一階段主要是細菌附著于導管等基質物體表面，該基質可輔助菌株逃避機體免疫系統殺傷，隨后菌株分泌細胞外多糖物質，生物膜形成進入不可逆的第二階段，多糖物質累積到一定程度后生物膜形成進入第三階段，活性菌株包被在復雜的生物分子層內[13]。生物膜可通過藥物滲透限制和菌株營養限制等機制導致菌株對常規抗菌藥物的抗藥性增加約1 000倍，大大增加了感染的難治程度[14]。本研究發現，本院肺炎克雷伯菌生物膜形成率達77.62%，與國內學者的報道相近[7,15]，重癥醫學科、呼吸危重癥科、其余科室間有生物膜形成的菌株占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)，提示臨床各科室均應密切關注有生物膜形成菌株的感染情況，尤其是進行留置導管等侵入性操作患者的感染情況。對抗菌藥物敏感性分析發現，生物膜形成菌株對頭孢曲松、頭孢吡肟和頭孢呋辛的不敏感率較無生物膜形成菌株高(P<0.05)，提示細菌生物膜的形成可能是菌株對頭孢類抗菌藥物耐藥的機制，有待進一步研究。生物膜形成菌株對部分頭孢類抗菌藥物的高耐藥性會給臨床治療帶來挑戰，因此在患者發生肺炎克雷伯菌感染時應重點關注菌株生物膜形成能力，選擇合適的治療藥物，避免生物膜形成所致導管或其他侵入性操作相關的難治性感染。研究顯示，產ESBL的肺炎克雷伯菌在世界范圍內達50%的覆蓋率，社區的分離率達30%[5]，碳青霉烯類藥物是治療產ESBL菌株感染的首選藥物，控制產ESBL菌株的流行至關重要。本研究共檢出14株產ESBL肺炎克雷伯菌， 重癥醫學科、呼吸危重癥科和其余科室產ESBL肺炎克雷伯菌占比比較，差異無統計學意義(P>0.05)。有學者報道，ESBL與肺炎克雷伯菌生物膜形成密切相關[7]，但本研究數據顯示，產ESBL菌株與非產ESBL菌株生物膜形成能力無明顯差異，本研究結果與上述研究結果存在一定差異可能與不同研究菌株的地域分布差異有關，也可能與本研究納入菌株數較少有關。

綜上所述，本院分離的肺炎克雷伯菌生物膜形成率較高，這使臨床感染治療面臨極大的挑戰，應引起臨床重視。生物膜形成直接影響菌株對抗菌藥物的敏感性，關于其耐藥機制的研究可為抗感染治療提供新的靶點，為新藥研發提供新的思路。建議臨床開展廣泛監測，對于有肺炎克雷伯菌感染并進行了侵入性操作的患者應預防生物膜形成。臨床上應完善抗菌藥物使用規范，重點關注有生物膜形成菌株的感染情況，合理使用抗菌藥物。但由于本研究納入的菌株數有限，CRKP菌株和產ESBL菌株較少，使本研究結果可能存在一定偏倚，后續將繼續收集菌株，為感染控制措施的制訂和院內感染控制提供參考依據。