基于焦磷酸測序的CYP2C19*2、CYP2C19*3基因分型方法性能驗證*

張婕妤，初亞男，李玉嬌，封利穎

東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院臨床藥學(xué)科，江蘇南京 210002

藥物基因組學(xué)是一門研究與藥物吸收、代謝和轉(zhuǎn)運相關(guān)的遺傳因素如何影響藥物治療效果或不良反應(yīng)的學(xué)科[1-3]。細胞色素P450 2C19(CYP2C19)是細胞色素P450超家族的一種同工酶，參與約2%的藥物代謝過程[4-5]。CYP2C19擁有的多種基因多態(tài)性表現(xiàn)為不同的酶活性，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3的多態(tài)性與氯吡格雷抵抗、質(zhì)子泵抑制劑的療效相關(guān)[6-7]。臨床藥物基因組學(xué)實施聯(lián)盟(CPIC)、荷蘭藥物遺傳學(xué)工作組(DPWG)和加拿大藥物基因組學(xué)藥品安全網(wǎng)(CPNDS)均建議臨床在使用氯吡格雷和質(zhì)子泵抑制劑等藥物前檢測CYP2C19基因型[8-9]。根據(jù)《醫(yī)學(xué)實驗室質(zhì)量和能力認可準(zhǔn)則(IS015189:2012.IDT) :CNA5-CL02》和江蘇省臨床檢驗中心對臨床基因擴增檢驗實驗室的要求[10-11]，任何一項用于常規(guī)檢測的項目在引入臨床使用前必須通過性能驗證。定性檢測的性能指標(biāo)包括最低檢測濃度、準(zhǔn)確度、特異度和重復(fù)性/精密度等。本文旨在對實驗室自建焦磷酸測序檢測CYP2C19*2(rs424485,c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893,c.636G>A)單核苷酸多態(tài)性的方法進行性能驗證，保證其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確、穩(wěn)定及可靠。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2020年9月至2022年5月在東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院進行CYP2C19*2、CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性檢測的乙二胺四乙酸抗凝全血標(biāo)本作為研究對象。

1.2儀器與試劑 Wizard?基因組DNA提取試劑盒(美國Promega公司)；TaKaRa TaqTM(日本TaKaRa公司)；PyroMark Gold Q96 Reagents、Annealing buffer和Binding buffer(德國QIAGEN公司)；Streptavidin SepharoseTMHigh Performance(美國GE Healthcare Life Sciences公司)；屈臣氏蒸餾水。Q24焦磷酸測序儀(德國QIAGEN公司)；A200基因擴增儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；微量紫外分光光度計(南京伍義科技有限公司)；VORTEX-GENIE 2渦漩混勻器(美國Scientific Industries基因公司)；Legand Micro 21R冷凍離心機(美國Thermo Fisher Scientific公司)。所有引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

表1 檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性的引物序列

1.3方法

1.3.1基因組DNA(gDNA)提取 根據(jù)DNA提取試劑盒說明書提取血液標(biāo)本中的gDNA。選取濃度≥30 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0的gDNA標(biāo)本儲存在-30 ℃冰箱中備用。

1.3.2PCR擴增 反應(yīng)體系為50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，5 U Taq酶0.25 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，gDNA 1 μL，蒸餾水補全總體系至50 μL。擴增程序：94 ℃ 5 min；擴增35個循環(huán)(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 7 min。

1.3.3焦磷酸測序 取20 μL PCR產(chǎn)物、2 μL Sepharose、18 μL蒸餾水、40 μL Binding buffer振蕩混勻8 min，再制備單鏈至已加入1 μL 10 μmol/L的測序引物和24 μL Annealing buffer的24孔板中，80 ℃孵育30 s，室溫放置1 min。CYP2C19*2位點核苷酸推注順序為CCTTGA,CYP2C19*3位點核苷酸推注順序為GGAATC。檢測結(jié)果可由儀器分析后自動判讀，也可根據(jù)信號峰的比值來判斷。

1.3.4最低檢測濃度驗證 隨機挑選CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型分別為*1*2型和*1*3型的gDNA標(biāo)本各1份，用DNA Rehydration Buffer梯度稀釋成10.0、2.0、0.4 ng/μL，每個濃度梯度設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3.5準(zhǔn)確度驗證 隨機選取20份臨床gDNA標(biāo)本進行焦磷酸測序，并將擴增產(chǎn)物送至深圳市華大科技有限公司進行雙向Sanger測序驗證。

1.3.7特異度驗證 選取經(jīng)焦磷酸測序驗證CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型均為*1*1型(野生型)的gDNA標(biāo)本各10份，將其擴增產(chǎn)物送至深圳市華大科技有限公司進行雙向Sanger測序。

1.3.8臨床標(biāo)本檢測 對2021年1月至2022年5月本院臨床科室申請進行CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性檢測的144份血液標(biāo)本進行焦磷酸測序。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以例數(shù)或百分率表示，Hardy-Weinberg平衡驗證采用χ2檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1最低檢測濃度 由于雜合型標(biāo)本的熒光強度只有野生型或突變型標(biāo)本的一半，因此選擇CYP2C19*2和CYP2C19*3位點的雜合型標(biāo)本進行檢測更能反映最低檢測濃度。不同濃度標(biāo)本的焦磷酸測序結(jié)果與稀釋前結(jié)果比對一致，焦磷酸測序儀可分析濃度低至0.4 ng/μL的gDNA標(biāo)本，故該方法的最低檢測濃度為0.4 ng/μL。

2.2準(zhǔn)確度 20份臨床gDNA標(biāo)本進行焦磷酸測序，分別檢測出9份CYP2C19*2*1*1型，10份CYP2C19*2*1*2型，1份CYP2C19*2*2*2型；19份CYP2C19*3*1*1型，1份CYP2C19*3*1*3型，未檢測出CYP2C19*3*3*3型。與Sanger測序驗證結(jié)果比對，兩種檢測方法結(jié)果完全符合(圖1)，焦磷酸測序方法準(zhǔn)確度為100%。

注：A為CYP2C19*2*1*1型測序結(jié)果；B為CYP2C19*2*1*2型測序結(jié)果；C為CYP2C19*2*2*2型測序結(jié)果；D為CYP2C19*3*1*1型測序結(jié)果；E為CYP2C19*3*1*3型測序結(jié)果。

2.3特異度 10份CYP2C19*2和10份CYP2C19*3基因型均為野生型的gDNA標(biāo)本，對其擴增產(chǎn)物進行雙向Sanger測序均未檢出突變型，檢測特異度為100%。

2.4重復(fù)性 CYP2C19*2*1*2型gDNA標(biāo)本的兩個等位基因C和T的熒光信號值CV分別為4.20%和4.40%，CYP2C19*3*1*3型gDNA標(biāo)本的兩個等位基因A和G的熒光信號值CV分別為3.75%和3.21%，均<5%，重復(fù)性驗證符合要求，見表2。

表2 CYP2C19*2*1*2和CYP2C19*3*1*3型重復(fù)性驗證結(jié)果

2.5臨床標(biāo)本檢測 144份臨床標(biāo)本的焦磷酸測序結(jié)果顯示，CYP2C19*2多態(tài)性位點*1*1型(野生型)71份(49.3%)，*1*2型(雜合型)59份(41.0%)，*2*2型(突變型)14份(9.7%)；CYP2C19*3多態(tài)性位點*1*1型(野生型)139份(96.5%)，*1*3型(雜合型)5份(3.5%)，未檢出*3*3型(突變型)標(biāo)本(在中國人群中分布頻率極低)，分布情況符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

3 討 論

藥物基因組學(xué)結(jié)合了藥理學(xué)和基因組學(xué)，主要用于探索有效、安全的藥物和使用劑量，在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中有著重要的意義[12-14]。藥物基因組學(xué)的檢測可用于指導(dǎo)醫(yī)師采取更好的治療決策，根據(jù)人體的基因型精準(zhǔn)選擇藥物及劑量[15]。CYP2C19是CYP2C酶體系的一員，其基因多態(tài)性可導(dǎo)致酶活性的差異[16]。CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性是中國人群中常見的突變，分別會導(dǎo)致酶活性喪失和形成無活性的酶蛋白[17]。對于攜帶兩個CYP2C19*2和CYP2C19*3功能缺失性等位基因的患者，如果常規(guī)使用氯吡格雷，發(fā)生心血管事件的風(fēng)險將明顯增加，因此治療前應(yīng)進行CYP2C19基因型檢測，以減少不良事件發(fā)生風(fēng)險[18-19]。奧美拉唑經(jīng)CYP2C19代謝形成無活性的代謝產(chǎn)物，不同的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型會造成不同的人體血藥濃度，進而形成抑酸療效上的差異，因此需要針對基因型進行劑量調(diào)整[20]。

目前，檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性的一些方法已通過性能驗證，但關(guān)于焦磷酸測序的方法學(xué)驗證報道少見。因此，本研究根據(jù)江蘇省臨床檢驗中心對擴增實驗室的要求和醫(yī)學(xué)界普遍執(zhí)行的關(guān)于醫(yī)學(xué)實驗室能力要求的標(biāo)準(zhǔn)ISO15189，設(shè)計了4個方面的性能驗證。經(jīng)驗證，本研究采用焦磷酸測序檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性的最低檢測濃度為0.4 ng/μL；采用Sanger測序為參考方法，兩種方法測序結(jié)果完全符合，準(zhǔn)確度為100%；特異度驗證中真陰性野生型標(biāo)本均未檢出陽性突變，特異度良好；批內(nèi)重復(fù)檢測4次結(jié)果穩(wěn)定。上述結(jié)果提示該方法性能指標(biāo)符合藥物基因組學(xué)檢測項目的要求，符合臨床基因擴增檢驗實驗室檢測質(zhì)量要求。

綜上所述，本文建立的基于焦磷酸測序檢測CYP2C19*2和CYP2C19*3單核苷酸多態(tài)性的方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、靈敏度高，能為臨床提供可靠結(jié)果，進而為臨床使用氯吡格雷、質(zhì)子泵抑制劑和抗抑郁藥等提供個體化指導(dǎo)。