糖尿病視網(wǎng)膜病變及糖尿病性黃斑水腫患者血清中CTRP9的表達(dá)

景海霞，張 書(shū)，白惠玲，劉 勤，，朱曉燕

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)的眼部微血管并發(fā)癥。Yang等[1]調(diào)查發(fā)現(xiàn)，成年T2DM患者中DR的患病率為24.7%～37.5%，約1/10的T2DM患者將發(fā)展為威脅視力的DR[2]。由于T2DM的全球患病率持續(xù)上升，越來(lái)越多的患者受到DR的困擾，其中糖尿病性黃斑水腫(diabetic macular edema，DME)和增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy，PDR)是導(dǎo)致患者中、重度視力喪失的主要原因。C1q/腫瘤壞死因子相關(guān)蛋白9(C1q/tumor necrosis factor related protein 9，CTRP9)是一種主要由脂肪細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，已被證明與糖尿病及其相關(guān)并發(fā)癥進(jìn)展有關(guān)，但其在DR中的作用和機(jī)制目前尚不清楚。本研究通過(guò)分析不同階段DR及DME患者血清中CTRP9的表達(dá)水平，探討CTRP9在DR及DME發(fā)病中的作用，為早期預(yù)防及監(jiān)測(cè)病情變化尋找有價(jià)值的生物學(xué)指標(biāo)。

1 對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2021-04/2022-04甘肅省人民醫(yī)院眼科及內(nèi)分泌科收治的T2DM患者135例作為試驗(yàn)組，根據(jù)免散瞳眼底照相結(jié)果分為無(wú)DR(non-DR，NDR)組(45例)、非增殖型DR(non-proliferative DR，NPDR)組(45例)、PDR組(45例)；根據(jù)光學(xué)相干斷層掃描(optical coherence tomography，OCT)結(jié)果將DR患者分為DME組(51例)、非DME組(39例)，眼底照相及OCT讀片均由同一位經(jīng)驗(yàn)豐富的眼底病醫(yī)生完成。另選取同期年齡、性別與T2DM患者相匹配的健康體檢者45例為正常對(duì)照組。本研究符合《赫爾辛基宣言》原則，經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)：2021-301)。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.1.1納入標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組：(1)年齡：45～75歲，經(jīng)內(nèi)分泌和眼科醫(yī)生明確診斷為T(mén)2DM或DR的患者；(2)T2DM的診斷符合2020年制定的《中國(guó)2型糖尿病防治指南》[3]；(3)DR分期符合《我國(guó)糖尿病視網(wǎng)膜病變臨床診療指南(2014年版)》中建議的分期方法[4]。正常對(duì)照組：無(wú)糖尿病病史，空腹血糖<7.0mmol/L，隨機(jī)血糖<11.0mmol/L，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)<6.5%。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)組：(1)1型糖尿病、妊娠期糖尿病、特殊類(lèi)型糖尿病患者；(2)既往有眼內(nèi)手術(shù)史、眼內(nèi)注藥史(抗VEGF藥物或糖皮質(zhì)激素)、視網(wǎng)膜激光光凝史；(3)有免疫性疾病、心腦血管疾病、血液系統(tǒng)疾病、惡性腫瘤、重度肝腎功能不全、嚴(yán)重感染性疾病者；(4)近期有抗炎、激素及免疫抑制劑藥物治療史；(5)近期有糖尿病高滲性昏迷、糖尿病酮癥酸中毒者。正常對(duì)照組：糖尿病、高血壓、合并心肝腎等嚴(yán)重功能障礙或患有其他全身性疾病，如炎癥性疾病、風(fēng)濕病、感染性疾病、惡性腫瘤及自身免疫性疾病者。

1.2方法

1.2.1臨床資料收集記錄所有受試者的性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index，BMI)及T2DM患者的糖尿病病程等臨床資料。

1.2.2CTRP9及生化指標(biāo)的檢測(cè)收集所有受試者晨起空腹肘靜脈血5mL。以4500r/min離心10min，立即提取上層血清，分裝入無(wú)菌EP管內(nèi)，置于-80℃超低溫冰箱中待測(cè)。(1)血清CTRP9水平檢測(cè)：采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)血清中CTRP9水平，嚴(yán)格按照試劑盒(江蘇菲亞生物科技有限公司)說(shuō)明操作進(jìn)行，CTRP9可檢測(cè)水平為17.5～700pg/mL，批內(nèi)及批間變異系數(shù)分別小于10%和12%。(2)生化指標(biāo)檢測(cè)：使用Ci16200全自動(dòng)化生化分析儀檢測(cè)空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、甘油三酯(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C)；使用TOSOH HLC-723G11分析儀檢測(cè)HbA1c。

2 結(jié)果

2.1納入受試者臨床資料比較正常對(duì)照組、NDR組、NPDR組、PDR組受試者年齡及性別差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但NDR組、NPDR組、PDR組患者糖尿病病程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。DME組與非DME組患者年齡、性別、糖尿病病程差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表2。

表1 各組受試者基線資料比較

表2 DME組與非DME組患者基線資料比較

正常對(duì)照組、NDR組、NPDR組、PDR組受試者血清CTRP9水平差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.001)，且正常對(duì)照組>NDR組>NPDR組>PDR組，見(jiàn)表3。DME組與非DME組患者血清CTRP9水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，且非DME組>DME組，見(jiàn)表4。

表3 各組受試者臨床資料比較

表4 DME組與非DME組患者臨床資料比較

2.2血清CTRP9水平與臨床資料的相關(guān)性分析Spearman秩相關(guān)性分析顯示，T2DM患者血清CTRP9水平與糖尿病病程(rs=-0.345，P<0.001)、HbA1c(rs=-0.181，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，與BMI(rs=0.199，P<0.05)呈正相關(guān)關(guān)系；DR患者血清CTRP9水平與糖尿病病程(rs=-0.251，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系；DME患者血清CTRP9水平與FBG(rs=-0.370，P<0.05)、HbA1c(rs=-0.421，P<0.05)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。

2.3DR及DME發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析

2.3.1DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析以是否發(fā)生DR為因變量，將糖尿病病程、BMI、HbA1c、HDL-C、CTRP9作為自變量，采用一次性進(jìn)入法進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，糖尿病病程(OR=1.194，95%CI：1.068～1.335)、血清CTRP9水平(OR=0.936，95%CI：0.907～0.966)為影響DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素，且隨著血清CTRP9水平降低，DR的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，見(jiàn)表5。

表5 DR危險(xiǎn)因素的Logistic回歸分析

2.3.2DME發(fā)生的危險(xiǎn)因素分析以是否發(fā)生DME為因變量，將CTRP9作為自變量，將變量采用一次性進(jìn)入法進(jìn)行Logistic多因素回歸分析，結(jié)果顯示，血清CTRP9水平為影響DME發(fā)生的危險(xiǎn)因素(b=-0.176，SB=0.038，Waldχ2=21.424，OR=0.838，95%CI：0.778～0.903，P<0.001)，且隨著CTRP9水平降低，DME的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加。

3 討論

CTRP9是屬于CTRP家族的脂聯(lián)素旁系同源物之一，主要在脂肪組織中表達(dá)，與脂聯(lián)素形成異源三聚體。gCTRP9是CTRP9主要的循環(huán)亞型，其是CTRP9的C端球狀結(jié)構(gòu)域異構(gòu)體，CTRP9的蛋白水解切割則會(huì)導(dǎo)致球狀結(jié)構(gòu)域gCTRP9釋放[5]。CTRP9可對(duì)多種與T2DM相關(guān)的危險(xiǎn)因素起到抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，CTRP9在ob/ob肥胖小鼠脂肪組織、外周血中表達(dá)水平上調(diào)[6]，而CTRP9缺陷小鼠胰島素抵抗(insulin resistance，IR)加重[7]，這兩項(xiàng)研究結(jié)果提示血清CTRP9水平與機(jī)體肥胖狀態(tài)有關(guān)，且在改善IR方面有一定作用。Guan等[8]認(rèn)為，CTRP9是一種抗炎因子，與哮喘、神經(jīng)炎和DR等多種疾病炎癥因子的產(chǎn)生呈負(fù)相關(guān)。此外，CTRP9還具有保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的作用[9-10]。Jung等[10]研究發(fā)現(xiàn)，CTRP9可以激活血管內(nèi)皮細(xì)胞中的蛋白激酶，抑制白細(xì)胞黏附和血管炎癥的發(fā)生，且其過(guò)表達(dá)可抑制核因子-kappaB(nuclear factor-kappaB，NF-κB)的激活，說(shuō)明CTRP9有抗氧化應(yīng)激反應(yīng)的作用。以上研究表明，CTRP9在改善IR、抗炎、保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞及抗氧化應(yīng)激等方面發(fā)揮重要作用。

本研究結(jié)果顯示，正常對(duì)照組、NDR組、NPDR組、PDR組受試者血清CTRP9水平差異有統(tǒng)計(jì)意義(P<0.001)，且正常對(duì)照組>NDR組>NPDR組>PDR組，說(shuō)明CTRP9水平降低可能在DR的進(jìn)展中起重要作用。相關(guān)研究也表明，CTRP9水平降低是T2DM患者并發(fā)DR的危險(xiǎn)因素[11]。王欣榮等[12]研究顯示，CTRP9與T2DM患者并發(fā)DR獨(dú)立相關(guān)，且隨著DR的進(jìn)展，CTRP9水平呈下降趨勢(shì)，這與本研究結(jié)果一致。然而，在T2DM背景下，血清CTRP9水平與不同發(fā)展階段DR的相關(guān)性研究鮮有報(bào)道。本研究結(jié)果顯示，與NPDR組相比，PDR組患者血清CTRP9水平降低(P<0.05)，提示CTRP9與DR的嚴(yán)重程度有一定的相關(guān)性，即隨著血清CTRP9水平降低，DR的嚴(yán)重程度增加，提示血清高水平CTRP9對(duì)于DR可能是一種保護(hù)因素。一項(xiàng)關(guān)于小鼠的體內(nèi)研究表明，CTRP9過(guò)表達(dá)可降低空腹胰島素水平和空腹血糖，增加胰島素敏感性[13]。另有研究表明，CTRP9過(guò)表達(dá)可抑制細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的發(fā)生[14]，可在一定程度上阻止DR的發(fā)展。此外，一項(xiàng)關(guān)于視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞的研究報(bào)告發(fā)現(xiàn)，CTRP9除了有抗炎、抗氧化的作用，還可以改善視網(wǎng)膜的葡萄糖代謝、保護(hù)血管[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，與非DME組相比，DME組患者血清CTRP9的水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。DME的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及大量炎性因子和炎性介質(zhì)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是引起DME的重要內(nèi)源性介質(zhì)，其過(guò)度產(chǎn)生可促使視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞增殖和白細(xì)胞遷移，增加血管通透性，導(dǎo)致液體滲漏和視網(wǎng)膜新生血管形成[16]。研究表明，抗VEGF藥物治療可改善DME患者黃斑灌注狀態(tài)并提高視力[17]，是DME的臨床一線治療方法。一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究通過(guò)將表達(dá)CTRP9的腺病毒載體靜脈注射到12周齡的db/db小鼠中發(fā)現(xiàn)，CTRP9可以平衡VEGF的表達(dá)[18]，提示CTRP9可能與VEGF的表達(dá)有關(guān)，但二者間的關(guān)系還需更多研究論證。此外，CTRP9還可抑制db/db小鼠血-視網(wǎng)膜屏障(blood retinal barrier，BRB)的分解和緊密連接蛋白的下調(diào)，研究人員通過(guò)免疫熒光染色和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)Claudin-5、Occludin和ZO-1等緊密連接蛋白的水平評(píng)估CTRP9對(duì)BRB完整性的影響，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，DR組Claudin-5、Occludin和ZO-1等緊密連接蛋白的mRNA水平顯著降低[18]，表明CTRP9可通過(guò)防止緊密連接蛋白的丟失保護(hù)BRB的完整性，從而抑制DME的發(fā)生發(fā)展。

CTRP9作為一種新型脂肪因子，在脂代謝的調(diào)節(jié)方面也發(fā)揮著一定的作用。汪化文等[19]發(fā)現(xiàn)，冠狀動(dòng)脈鈣化患者血清CTRP3、CTRP9水平與部分血脂指標(biāo)水平具有明顯相關(guān)性，與TC、TG水平呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C水平呈正相關(guān)。一項(xiàng)關(guān)于金銀花調(diào)節(jié)血糖和血脂水平的研究指出，CTRP3/9-AdipoR1-AMPK通路對(duì)保護(hù)性脂質(zhì)(甘油二酯、HDL-C)具有一定保護(hù)作用[20]。雷升云[21]采用不同濃度CTRP9刺激巨噬細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，CTRP9可顯著減少巨噬細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，同時(shí)還證明CTRP9可促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出相關(guān)蛋白的表達(dá)及膽固醇的流出。上述研究提示CTRP9與脂代謝產(chǎn)物有一定的相關(guān)性。本研究中Spearman秩相關(guān)性結(jié)果顯示，T2DM及DR患者血清CTRP9水平與脂代謝產(chǎn)物無(wú)顯著相關(guān)性，其他關(guān)于DR患者血清CTRP9的相關(guān)研究中也暫未發(fā)現(xiàn)其與脂代謝產(chǎn)物的相關(guān)性，分析原因可能與患者服用了降糖降脂藥物有一定關(guān)系。

然而，本研究顯示，隨著血清CTRP9水平降低，DR與DME的患病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，但CTRP9具體通過(guò)何種機(jī)制參與DR及DME的發(fā)生與發(fā)展，還有待進(jìn)一步探討。目前認(rèn)為，CTRP9可通過(guò)激活幾種信號(hào)通路發(fā)揮改善胰島素敏感性、降低血糖、減輕炎癥反應(yīng)、抗氧化應(yīng)激及保護(hù)血管內(nèi)皮的作用。Zuo等[22]研究顯示，CTRP9可激活A(yù)MP依賴(lài)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)、蛋白激酶B(Akt)及絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)血清胰島素及葡萄糖水平。Jung等[10]研究顯示，CTRP9通過(guò)激活脂聯(lián)素受體1(adiponectin receptor 1，AdipoR1)/AMPK/NF-κB信號(hào)通路，下調(diào)腫瘤壞死因子-α、黏附分子及趨化因子的表達(dá)，減輕血管炎癥。此外，CTRP9還可通過(guò)激活A(yù)MPK/核紅細(xì)胞2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2)信號(hào)通路，減弱高血糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞中的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡的發(fā)生[15]。上述研究結(jié)果表明，CTRP9與T2DM及DR的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

隨著醫(yī)療水平及檢測(cè)技術(shù)的提高，目前多數(shù)DR患者可通過(guò)早期診斷與及時(shí)干預(yù)有效避免視力嚴(yán)重下降。因此，尋找相應(yīng)的分子標(biāo)志物對(duì)DR及DME的早期診斷、預(yù)防或干預(yù)具有重要意義。本研究中，Logistic回歸分析結(jié)果顯示，血清CTRP9水平是影響DR及DME發(fā)生的危險(xiǎn)因素，提示CTRP9未來(lái)有可能成為預(yù)防和治療DR及DME的功能靶點(diǎn)。Zhang等[23]發(fā)現(xiàn)，gCTRP9作為CTRP9的亞型，對(duì)AMPK、Akt和內(nèi)皮一氧化氮合酶的激活作用比CTRP9更強(qiáng)。因此，促進(jìn)gCTRP9的產(chǎn)生可能是增強(qiáng)CTRP9生物學(xué)功能的有效途徑。后續(xù)將進(jìn)一步研究CTRP9與DR及DME有關(guān)的潛在機(jī)制，可能有助于預(yù)防或延緩其進(jìn)展并探索新的治療策略。

綜上所述，血清CTRP9水平降低是DR及DME發(fā)生的危險(xiǎn)因素，其可能成為臨床上監(jiān)測(cè)T2DM患者并發(fā)DR及DME的潛在參考指標(biāo)，為預(yù)防或延緩DR及DME的發(fā)生提供參考。由于本研究是小樣本橫斷面研究，因此僅初步推斷CTRP9在預(yù)測(cè)DR及DME的發(fā)生發(fā)展方面具有一定價(jià)值，未來(lái)還需進(jìn)行多中心、大樣本的臨床研究加以證實(shí)。另有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病是影響DR發(fā)生的危險(xiǎn)因素[24]，本研究未能排除糖尿病腎病的影響。此外，由于T2DM患者病程較長(zhǎng)，且多數(shù)患者服用降糖、降脂、保護(hù)神經(jīng)等藥物，因此CTRP9與血管并發(fā)癥之間的關(guān)聯(lián)可能受到藥物等相關(guān)混雜因素的影響。