莪術醇抑制VEGF誘導的新生血管生成的實驗研究

郝雨檬，王彩霞，馬景學，李雪景，尚慶麗

0 引言

新生血管生成在多種疾病致病中發(fā)揮重要作用，主要包括腫瘤血管、眼底新生血管、冠狀動脈斑塊新生血管等[1]。眼底新生血管包括視網(wǎng)膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)和脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)常發(fā)生于糖尿病視網(wǎng)膜病變、年齡相關性黃斑變性、病理性近視等致盲性眼病中，是視力喪失的重要原因。眼底新生血管的發(fā)生機制尚不明確，與基因異常、缺氧、氧化應激、炎癥等因素均相關，是多種細胞和因子共同作用的結果，其中血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)發(fā)揮關鍵作用[2-3]。目前臨床主要采用玻璃體腔注射抗VEGF藥物治療RNV和CNV，但存在作用靶點單一、復發(fā)率高、反復注射引起纖維瘢痕化和視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium，RPE)萎縮等問題[4]。中藥及中藥單體安全、高效、價廉、多靶點，可為藥物防治眼底新生血管提供新的思路和方法。莪術醇(Curcumol)，分子式C15H24O2，倍半萜類，是中藥莪術的主要活性成分，具有抗腫瘤、抗炎、抗纖維化等多種生物活性，臨床應用廣泛，但在新生血管生成中的作用尚不明確[5-6]。人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)是體外常用的內皮細胞模型，也是RNV和CNV體外研究常用的細胞模型[7-9]。本研究利用HUVECs體外分析莪術醇對新生血管生成的抑制作用，為后續(xù)其應用于眼底新生血管的治療研究提供理論和技術支持。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1細胞HUVECs細胞購自湖北豐輝生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器莪術醇(HY-N0104，美國MedChemExpress公司)，VEGF(100-20，美國PeproTech公司)，DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)，胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)(以色列 Biological Industries公司)，CCK-8檢測試劑盒(HY-K0301，美國MedChemExpress公司)，EdU-594細胞增殖檢測試劑盒(C0078，碧云天生物技術公司)，Transwell小室(8.0μm，24孔，3422，美國Corning公司)，Matrigel基質膠(356234，美國Corning公司)，β-actin(20536-1-AP，武漢三鷹生物技術公司)，Akt(4691)、p-Akt(4060)、S6(2217)和p-S6(4858)抗體(美國Cell Signaling Technology公司)。細胞培養(yǎng)箱、低溫高速離心機(美國Thermo公司)，倒置相差顯微鏡(日本Olympus公司)，激光共聚焦顯微鏡(德國Carl Zeiss公司)，酶標儀(美國BioTek公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及分組HUVECs細胞用含10% FBS和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞生長至90%融合時，采用0.25%胰酶消化，1∶2傳代，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗。莪術醇用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)配制為400mmol/L儲備液，使用時用培養(yǎng)基稀釋為相應濃度。將細胞分為對照組、VEGF組、莪術醇+VEGF組，實驗組培養(yǎng)基中分別加入相應濃度莪術醇和/或50ng/mL VEGF，對照組加入0.1%DMSO。

1.2.2CCK-8法檢測細胞增殖取1×104/mL細胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后用無FBS的培養(yǎng)基饑餓24h，分別用各濃度莪術醇和VEGF處理24h，各孔更換新鮮培養(yǎng)基，向每孔加入10μL CCK-8溶液，置于37℃培養(yǎng)箱內孵育1h，酶標儀測定450nm處吸光度。

1.2.3EdU實驗檢測細胞增殖取1×104/mL細胞接種于96孔板中，過夜培養(yǎng)后用無FBS的培養(yǎng)基饑餓24h，分別用各濃度莪術醇和VEGF處理24h，加入等體積的10mmol/L EdU，繼續(xù)孵育2h；然后用4%多聚甲醛固定，0.3% Triton X-100通透，加入50μL反應液，室溫避光孵育30min，Hoechst 33342溶液進行細胞核染色，熒光顯微鏡下觀察并拍照，增殖細胞(EdU陽性)在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)紅色熒光。

1.2.4Transwell遷移實驗分析細胞遷移用無FBS培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞24h，重懸細胞為 2×105/mL，加入不同濃度莪術醇，向Transwell小室的上室加入100μL細胞懸液，下室加入600μL含10% FBS和/或50ng/mL VEGF的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24h；取出小室，加入4%多聚甲醇固定，0.1%結晶紫染色細胞，棉簽擦除小室內面未穿過的細胞，PBS洗凈，顯微鏡下隨機選取5個視野計算遷移細胞數(shù)。

1.2.5管腔形成實驗分析血管生成將Matrigel膠放入4℃冰箱過夜融化，加入預冷的48孔板中，每孔100μL，置于37℃培養(yǎng)箱中凝固1h。取對數(shù)生長期細胞制成2.5×105/mL的細胞懸液，各組加入不同濃度的莪術醇和VEGF處理，各取100μL加入到Matrigel膠的孔板中，培養(yǎng)24h，顯微鏡下觀察管腔形成情況，隨機選取5個視野，Image J軟件計算管腔的分支數(shù)量和長度。

1.2.6Westernblot分析p-Akt和p-S6表達收集HUVECs細胞，提取總蛋白，BCA法測定樣本蛋白含量。SDS-PAGE分離蛋白，隨后將蛋白質轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1h，分別加入抗p-Akt(1∶1000)、抗p-S6(1∶2000)、抗Akt(1∶2000)、抗S6(1∶2000)和抗β-actin(1∶1000)一抗，4℃孵育過夜；TBST洗滌3次，加入HRP標記的二抗，室溫作用1h，TBST洗滌3次后加入ECL反應液，BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)進行拍照；Image J軟件對蛋白條帶進行灰度分析，通過分析目的蛋白與內參對照灰度比值計算目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1各組細胞增殖能力比較CCK-8實驗結果顯示，各組細胞OD450值總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=18.346，P<0.001)；其中，VEGF組OD450值顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=3.80，P<0.01)；50、100、200μmol/L莪術醇+VEGF組OD450值與VEGF組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.49、-0.71、-1.10，均P>0.05)，400、800μmol/L莪術醇+VEGF組OD450值顯著低于VEGF組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.49，P<0.01；t=-8.58，P<0.001)，見圖1。但800μmol/L莪術醇+VEGF組OD450值低于對照組，可能會抑制正常細胞功能，故后續(xù)實驗僅采用200、400μmol/L莪術醇處理細胞。

圖1 CCK-8實驗中各組細胞OD450值比較 bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs VEGF組。

EdU實驗結果顯示，各組細胞增殖率總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=27.814，P<0.001)；其中，VEGF組細胞增殖率高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=6.11，P<0.001)；200μmol/L莪術醇+VEGF組細胞增殖率與VEGF組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-1.41，P>0.05)；400μmol/L莪術醇+VEGF組細胞增殖率顯著低于VEGF組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-7.83，P<0.001)，見圖2。

圖2 各組細胞EdU染色結果比較 A：各組細胞EdU染色的熒光顯微鏡像，紅色示EdU染色陽性細胞，藍色示Hoechst 33342細胞核染色；B：定量比較各組細胞增殖率，bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs VEGF組。

2.2各組細胞遷移率比較Transwell實驗結果顯示，各組細胞遷移數(shù)總體比較差異有統(tǒng)計學意義(F=49.132，P<0.001)；其中，VEGF組遷移細胞數(shù)相比對照組明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.65，P<0.001)；200μmol/L莪術醇+VEGF組細胞遷移數(shù)與VEGF組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=2.09，P>0.05)；400μmol/L莪術醇+VEGF組遷移細胞數(shù)相比VEGF組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=-9.34，P<0.001)，見圖3。

圖3 Transwell實驗中各組細胞遷移比較 A：各組遷移細胞的顯微鏡像；B：定量比較各組遷移細胞數(shù)，bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs VEGF組。

2.3各組細胞管腔形成能力比較管腔形成實驗結果顯示，各組細胞形成管腔的分支數(shù)量和分支長度總體比較差異均有統(tǒng)計學意義(F=32.585、23.179，均P<0.001)；其中，VEGF組形成管腔的分支數(shù)量和分支長度高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(t=7.23、5.99，均P<0.001)；200μmol/L莪術醇+VEGF組細胞形成管腔的分支數(shù)量和分支長度與VEGF組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=-0.22、-0.57，均P>0.05)；400μmol/L莪術醇+VEGF組細胞形成管腔的分支數(shù)量和分支長度明顯低于VEGF組，差異有統(tǒng)計學意義(t=-6.97、-6.33，均P<0.001)，見圖4。

圖4 各組細胞管腔形成情況 A：各組細胞形成管腔的顯微鏡像；B：定量比較各組細胞形成管腔的分支數(shù)量；C：定量比較各組細胞形成管腔的分支長度。bP<0.01 vs 對照組；dP<0.01 vs VEGF組。

2.4各組細胞p-Akt和p-S6表達水平比較為了分析莪術醇作用于血管生成的信號通路機制，本研究檢測Akt/mTORC1信號通路的關鍵效應因子p-Akt(S473)和p-S6(S235/236)的相對表達水平。Western blot檢測結果顯示，各組細胞Akt和S6相對表達水平總體比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=3.938、4.581，均P>0.05)，p-Akt和p-S6相對表達水平總體比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=10.113、5.407，均P<0.05)；其中，與對照組相比，VEGF組細胞p-Akt和p-S6相對表達水平差異無統(tǒng)計學意義(t=0.10、-0.78，均P>0.05)，而400μmol/L莪術醇+VEGF組細胞p-Akt和p-S6相對表達水平較VEGF組明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(t=-3.45、-2.90，均P<0.05)，見圖5。

圖5 Western blot檢測各組細胞p-Akt和p-S6蛋白表達水平 A：各組細胞蛋白表達電泳圖；B：定量比較各組細胞p-Akt相對表達水平，用p-Akt/Akt灰度值比值反映p-Akt相對表達水平；C：定量比較各組細胞p-S6相對表達水平，用p-S6/S6灰度值比值反映p-S6相對表達水平。aP<0.05 vs VEGF組。

3 討論

目前抗VEGF藥物治療作為RNV和CNV的一線治療方案，雖取得一定療效，但治療的局限性也很明顯：(1)藥物作用靶點單一，作用時間短，停藥后易復發(fā)，需要多次注射，有高于50%的患者在持續(xù)抗VEGF治療1a后仍存在活動性病灶；(2)反復注射引起的副作用，尤其是纖維瘢痕化和RPE萎縮，使患者術后視力恢復不良；(3)此類藥物價格昂貴[4，10]。因此，尋找新的治療藥物和方案顯得尤為迫切，安全、高效、價廉、多靶點的中藥及中藥單體是一個重要選擇。

莪術醇是中藥莪術(蓬莪術，廣西莪術和溫郁金等的干燥根莖)的揮發(fā)油中提取的單體，是莪術油中含量最高的有效成分[5]。現(xiàn)代藥理學研究顯示，莪術醇具有較強的抗癌作用，且具有低毒和不引起白細胞數(shù)量減少等優(yōu)點，對臨床多種腫瘤如肝癌、乳腺癌、胃癌和血液系統(tǒng)惡性腫瘤等均有一定的治療作用[11-12]。研究證實，莪術醇可靶向并抑制許多異常激活的細胞生長或存活相關的信號通路，從而誘導多種腫瘤細胞的凋亡或死亡，如PI3K/Akt/mTOR、Wnt、ERK/NF-κB信號通路等[13-15]。因此莪術醇可能通過抑制多種細胞生長信號通路，從而發(fā)揮抑制新生血管形成的功效。目前關于莪術醇對血管內皮細胞的作用研究還非常少，南京中醫(yī)藥大學的研究顯示莪術醇可抑制肝竇內皮細胞毛細血管化，是肝纖維化的潛在治療藥物[16-17]。另有研究顯示，莪術油可以抑制高糖下的人視網(wǎng)膜血管內皮細胞的增殖和VEGF表達，具有抗視網(wǎng)膜新生血管的作用[18]。本研究重點分析了中藥單體莪術醇對新生血管生成的抑制作用及機制，探討其應用于眼底新生血管治療的可能性。

內皮細胞的增殖、遷移及管腔形成是血管生成的必經(jīng)過程，VEGF在這一過程中起關鍵作用。既往關于CNV的研究中，恒河猴脈絡膜血管內皮細胞RF/6A經(jīng)常作為細胞模型，但2018年Makin等[19]證實RF/6A細胞已不再具有關鍵的內皮細胞性質。目前HUVECs仍是CNV體外研究常用的細胞模型，同時在RNV的研究中，HUVECs細胞模型也應用廣泛。本研究采用體外VEGF誘導HUVECs細胞增殖、遷移及管腔形成，觀察莪術醇對上述過程的影響和機制，為莪術醇應用于臨床治療眼底新生血管提供體外實驗基礎。本研究結果顯示，莪術醇可有效抑制HUVECs的增殖、遷移和管腔形成。分析不同濃度莪術醇的作用效果發(fā)現(xiàn)，當莪術醇濃度≤200μmol/L時無明顯抑制效果，而當濃度為400、800μmol/L時，莪術醇可以有效抑制內皮細胞增殖，但800μmol/L莪術醇使內皮細胞活性明顯低于未加VEGF的對照組，可能對內皮細胞的正常功能造成影響，因此后面的細胞實驗中未再采用此濃度，400μmol/L莪術醇可能是更安全且有效的，這為以后動物實驗探索體內給藥濃度提供了依據(jù)。

為了探究莪術醇抑制新生血管生成的分子機制，本研究檢測了Akt/mTORC1通路，其是調節(jié)細胞生長、代謝、分化的關鍵信號通路，Akt磷酸化后可激活mTORC1，S6為mTORC1下游的主要效應因子，磷酸化后可促進蛋白質合成，同時p-Akt可調控細胞存活和增殖。Akt/mTORC1通路在新生血管生成中發(fā)揮重要作用，在RNV和CNV動物模型中，通過玻璃體腔注射或口服抑制劑阻止Akt/mTORC1活化可顯著抑制新生血管形成[20-21]。此外，研究者也在嘗試將mTOR抑制劑應用于年齡相關性黃斑變性的臨床治療，可通過其多種藥理作用，包括抗炎、抗增殖、抗遷移和誘導自噬，在改善CNV和保護RPE方面發(fā)揮顯著功效[22-23]。本研究結果顯示莪術醇可以有效抑制內皮細胞中Akt和S6的磷酸化，抑制Akt/mTORC1通路活化，提示莪術醇抑制血管生成的一個可能機制是調控Akt/mTORC1通路。

本研究證實，莪術醇可在體外有效抑制VEGF誘導的血管內皮細胞增殖、遷移和血管形成，并抑制Akt/mTORC1通路活化，具有抑制新生血管的潛在作用。但本研究只是對莪術醇抑制新生血管作用的初步探索，應進一步在動物模型中深入分析莪術醇對RNV和CNV形成的作用與機制及其最佳給藥途徑和劑量、安全性、藥代動力學特征等，為莪術醇在眼底新生血管疾病中的科學使用提供更多依據(jù)。