在晶狀體損傷誘導(dǎo)的視神經(jīng)長時(shí)程再生過程中MMP-12的表達(dá)規(guī)律

王國棟，趙劍峰，徐星煜，向祥林，沈一葦，何子涵，劉 康，耿 宇

0 引言

視神經(jīng)損傷是臨床上嚴(yán)重的致盲因素之一。雖然屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的視神經(jīng)再生困難，但晶狀體損傷后能誘導(dǎo)受損視神經(jīng)軸突出現(xiàn)長時(shí)程再生[1]，軸突纖維可以達(dá)下丘腦形成有效突觸連接并改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物視覺電信號傳導(dǎo)[2]。有研究認(rèn)為，其機(jī)制可能為晶狀體蛋白誘導(dǎo)視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞存活并再生，也有研究認(rèn)為晶狀體損傷后誘發(fā)眼部局部炎癥在視神經(jīng)再生過程中起到了重要的作用[3-4]，但既往研究均不能完全解釋這種長時(shí)程視神經(jīng)再生的機(jī)制[1,5]。我們采用視神經(jīng)鉗夾伴晶狀體損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)長時(shí)程再生的動(dòng)物模型，對視神經(jīng)損傷區(qū)域進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，篩選出差異性高表達(dá)基因，并對篩選的高表達(dá)因子進(jìn)行后期分子生物學(xué)驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1材料本課題所用的24 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均在昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物部購買[許可證號：SCXK(滇)K2019-0002]，均為SPF級SD雄性大鼠，體質(zhì)量為180～200g。所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核通過。

1.2方法將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物24只分為對照組、晶狀體損傷組、視神經(jīng)損傷組、晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組，每組各6只大鼠。

1.2.1建立SD大鼠視神經(jīng)損傷模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，在眼球外眥部剪開外眥角，暴露部分眼眶脂肪，鈍性分離組織，盡可能暴露眼球后部的視神經(jīng)，在距眼球約0.2～0.5mm處鉗夾視神經(jīng)約10s，5min后檢眼鏡觀察 SD大鼠視網(wǎng)膜，觀察到大鼠視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈恢復(fù)血供[6]。外眥角手術(shù)切口涂紅霉素眼膏每日1次，預(yù)防感染，大鼠在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)。術(shù)后1wk大鼠眼部傷口愈合，無明顯眼部感染跡象。術(shù)后用檢眼鏡檢查眼底，排除視網(wǎng)膜血管損傷的SD大鼠。6只大鼠均建模成功，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.2建立大鼠外傷性白內(nèi)障模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，暴露晶狀體，在大鼠角鞏膜緣用30G胰島素針頭水平刺入眼內(nèi)，將晶狀體囊膜徹底破壞，術(shù)中可見部分晶狀體皮質(zhì)外溢。術(shù)后SD大鼠眼部連續(xù)涂紅霉素眼膏3d，每日1次，預(yù)防感染。術(shù)后1wk大鼠眼部傷口愈合，無明顯感染跡象，在裂隙燈顯微鏡下可見明顯的晶狀體白色混濁，晶狀體損傷模型建模成功。6只大鼠均建模成功，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3建立晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷模型6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后左眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，按照1.2.1和1.2.2方法建立晶狀體損傷和視神經(jīng)損傷模型，建模成功標(biāo)準(zhǔn)同上，6只大鼠均建模成功，適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.4對照組6只SD大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉(50mg/kg)全身麻醉，麻醉起效后右眼眼部涂0.5%硫酸阿托品凝膠充分散瞳，僅開放眼眶暴露視神經(jīng)，術(shù)后處理同前。術(shù)后術(shù)眼無感染的大鼠適用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。6只大鼠均納入后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.5轉(zhuǎn)錄組測序

1.2.5.1RNA提取鑒定和文庫制備建模成功后14d，視神經(jīng)損傷組取視神經(jīng)損傷區(qū)的組織為標(biāo)本，對照組和晶狀體損傷組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經(jīng)組織，提取總RNA后，在1%瓊脂糖凝膠上電泳檢測RNA降解和污染情況。使用Qubit?2.0熒光光度計(jì)中的Qubit?RNA分析試劑盒、NanoPhotometer?分光光度計(jì)和生物分析儀2100系統(tǒng)的RNA Nano 6000 Assay Kit評估濃度、純度、完整性。

每個(gè)測序樣本的RNA總量為3μg，使用NEB Next UltraTM RNA Library Prep Kit for Illumina?生成基因文庫測序，并將索引代碼添加到每個(gè)組別不同樣本的屬性行列中，即用聚T寡聚糖連接的磁珠從總RNA中提取mRNA。在NEBNext(5×)第一鏈合成反應(yīng)緩沖液中，用二價(jià)陽離子在升溫條件下對mRNA進(jìn)行裂解。使用MMuLV逆轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)六聚體引物合成第一鏈cDNA。使用RNA酶H和DNA聚合酶I進(jìn)行第二鏈cDNA的合成，剩余的突出物通過核酸外切酶/聚合酶的活性轉(zhuǎn)化為鈍端。DNA片段3'端腺基化后，連接具有發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)的NEBNext接頭，從而為下一步雜交鋪墊。應(yīng)用AMPure XP系統(tǒng)對基因文庫片段進(jìn)行過濾篩選，選出長度為250～300bp的cDNA片段。然后，使用3μL的USER酶與大小選擇、接頭連接的cDNA在37℃下反應(yīng)15min，然后在95℃下反應(yīng)5min，最后行PCR。使用Phusion High Fidelity DNA聚合酶、Index引物和通用PCR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再用AMPure XP系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行提純。

基因文庫建成后，用Qubit2熒光光度計(jì)對其初次定量，并將文庫濃度調(diào)整為1.5ng/μL，用Agilent 2100生物分析儀檢測文庫的插入規(guī)格。待插入片段大小與符合預(yù)期時(shí)，采用qRT-PCR準(zhǔn)確定量文庫的有效濃度。為確保基因文庫質(zhì)量其有效濃度須大于2nmol/L。

應(yīng)用TruSeq PE Cluster Kit v3-CBOT-HS在CBOT群集生成系統(tǒng)上對編碼樣本的群集進(jìn)行索引。最后，生成簇后，在Illumina NovaSeqTM平臺(tái)上對文庫制備進(jìn)行測序，并產(chǎn)生125bp/150bp的成對末端閱讀。

1.2.5.2有參轉(zhuǎn)錄組差異基因表達(dá)分析采用有參轉(zhuǎn)錄組無生物學(xué)重復(fù)模式，使用Edger程序包對于每個(gè)測序文庫，通過一個(gè)標(biāo)度歸一化因子來調(diào)整讀取計(jì)數(shù)，再進(jìn)行差異表達(dá)分析。使用Edger軟件包對兩種條件進(jìn)行差異表達(dá)分析。用Benjamini&Hochberg法調(diào)整P值。以校正P值為0.05，折疊式變化絕對值[log2(FoldChange)]為2作為差異表達(dá)的閾值。分析將所有差異表達(dá)的基因映射到GO數(shù)據(jù)庫中的每一項(xiàng)，計(jì)算每一項(xiàng)中的基因數(shù)量，篩選差異表達(dá)明顯富集的基因。

1.2.6qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

1.2.6.1總RNA提取建模成功后7、14、21、28d，過量麻醉處死SD大鼠，視神經(jīng)損傷組取損傷區(qū)視神經(jīng)組織稱重，晶狀體損傷組和對照組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經(jīng)組織，每取0.1g加入1500μL Trizol溶液，放入去酶EP管中。采用Trizol法提取視神經(jīng)總RNA。采用U-3010微量分光光度計(jì)(日本)進(jìn)行總RNA定量。

1.2.6.2引物合成采用premier5.0進(jìn)行特異性引物設(shè)計(jì)，經(jīng)NCBIBlast基因庫驗(yàn)證引物特異性，由北京擎科生物科技有限公司合成。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.6.3mRNA擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)按照PrimeScriptRTEnzymeMixI(TAKARA)試劑盒說明書進(jìn)行操作，構(gòu)建20μL反應(yīng)體系，反應(yīng)條件如下：(1)37℃，15min；(2)85℃，5s；(3)4℃保存。qRT-PCR按照TBGreenPremixExTaqII(TAKARA)試劑盒說明書進(jìn)行操作，構(gòu)建20μL擴(kuò)增體系，反應(yīng)條件如下：95℃(30s)→[95℃(5s)→60℃(34s)→95℃(15s)]×40→60℃(1min)→95℃(15s)。

1.2.7ELISA 視神經(jīng)損傷組取損傷區(qū)視神經(jīng)組織稱重，晶狀體損傷組和對照組取距眼球約0.2～0.5mm的視神經(jīng)組織稱重，加入9倍重量的PBS溶液，勻漿后，用5000r/min離心10min，取上清液。用稀釋液1∶4稀釋上清液(均用復(fù)孔檢測)后加入50μL至微孔內(nèi)，同時(shí)設(shè)置MMP-12梯度濃度標(biāo)準(zhǔn)品作為對照；將辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體(100μL)加入微孔內(nèi)，37℃溫箱進(jìn)行孵育60min。孵育完成后反復(fù)沖洗96孔板5次，加入底物A及底物B各50μL，然后37℃避光孵育15min。最后，每孔加終止液50μL，15min內(nèi)在450nm波長下讀取吸光度值，通過用標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而計(jì)算出各樣本濃度。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行分析，多組數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間比較方差齊時(shí)采用LSD-t檢驗(yàn)，方差不齊時(shí)采用Tamhane’sT2檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1有參轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果

2.1.1不同組別的主成因分析對照組和視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)聚集(綠色線框)，其第一主成因(PC1)和第二主成因(PC2)基本重合。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的PC1為 94.83%(藍(lán)色線框)，在成因分析中所占比例最大，是基因表達(dá)變化中的主要因素；晶狀體損傷組的PC2方差為 3.83%(藍(lán)色線框)，為次要因素(圖1)。

圖1 不同組別的主成因分析 綠色線框：對照組和視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)聚集；藍(lán)色線框：晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的PC1方差為 94.83%；晶狀體損傷組的PC2方差為 3.83%。

2.1.2不同組間基因表達(dá)差異分析視神經(jīng)損傷組和對照組比較，差異基因數(shù)最少，為164個(gè)基因。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組和視神經(jīng)損傷組比較，差異基因數(shù)最多，為3396個(gè)(表2)。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組和對照組比較時(shí)，MMP-12(基因ID：ENSRNOG00000030187)在晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組清理數(shù)據(jù)為1680.95，對照組的清理數(shù)據(jù)為1.00。定量分析比較兩組間差異的倍數(shù)變化為10.55。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的MMP-12的log2(FoldChange)值較高，基因表達(dá)上調(diào)10倍以上，對照組無明顯上調(diào)。伴有晶狀體損傷的各組中，均存在MMP-12基因表達(dá)上調(diào)。

表2 不同組間差異基因的數(shù)量

2.2不同時(shí)間各組間MMP-12的mRNA表達(dá)量比較建模成功后7d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.453，P>0.05)。建模成功后14d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=41.476，P<0.01)；晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組與對照組、視神經(jīng)損傷組和晶狀體損傷組比較，MMP-12 mRNA顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后21d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=103.843，P<0.01)；與對照組、視神經(jīng)損傷組和晶狀體損傷組比較，晶狀體聯(lián)合視神經(jīng)損傷組MMP-12 mRNA顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；晶狀體損傷組與視神經(jīng)損傷組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后28d，四組大鼠MMP-12 mRNA表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=1.266，P>0.05)，見圖2。

圖2 不同時(shí)間各組間MMP-12 的mRNA表達(dá)量比較 A：建模成功后7d；B：建模成功后14d；C：建模成功后21d；D：建模成功后28d；bP<0.01 vs 晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組;cP<0.05 vs晶狀體損傷組。

2.3不同時(shí)間各組間MMP-12蛋白表達(dá)量比較建模成功后7d，四組大鼠MMP-12蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.199，P<0.05)。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組與對照組和視神經(jīng)損傷組比較，MMP-12蛋白顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與晶狀體損傷組比較上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后14d，四組大鼠MMP-12蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.143，P<0.01)；晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組與對照組和視神經(jīng)損傷組比較，MMP-12蛋白表達(dá)顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；其余各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后21d，四組大鼠MMP-12蛋白表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=3.124，P<0.05)。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組MMP-12 蛋白表達(dá)與對照組比較顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，與視神經(jīng)損傷組比較上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其余各組間兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。建模成功后28d，四組大鼠MMP-12蛋白表達(dá)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.244，P>0.05)，見圖3。

圖3 不同時(shí)間各組間MMP-12蛋白表達(dá)量比較 A：建模成功后7d；B：建模成功后14d；C：建模成功后21d；D：建模成功后28d；aP<0.05,bP<0.01 vs晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組。

3 討論

成年期哺乳動(dòng)物視神經(jīng)受損后再生困難[7-8]，是長期以來亟待解決的臨床難題[9-10]。既往研究提示，視神經(jīng)損傷后軸突能夠在移植的外周神經(jīng)中再生[11]，提示視神經(jīng)有內(nèi)在的生長活性。一般情況下，鉗壓受損的視神經(jīng)再生不超過2wk[12]，再生的軸突短，甚至不到幾毫米，不能恢復(fù)視功能[13]。在視神經(jīng)受到擠壓性損傷同時(shí)伴有晶狀體損傷時(shí)，則會(huì)誘導(dǎo)受損的視神經(jīng)軸突發(fā)生長時(shí)程再生，這種再生現(xiàn)象可以持續(xù)達(dá)1mo，且再生纖維可以達(dá)下丘腦(下級神經(jīng)元所在區(qū)域)形成有效的突觸連接，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的視覺電生理有明顯改善[1-2]。在研究這種長時(shí)程再生的機(jī)制時(shí)，視神經(jīng)損傷區(qū)域和損傷的晶狀體中均未發(fā)現(xiàn)有腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)、神經(jīng)營養(yǎng)因子-4(neurotrophin-4，NT-4)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)、神經(jīng)生長因子(nerve growth factor，NGF)及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)等神經(jīng)營養(yǎng)因子的表達(dá)；使用這些細(xì)胞因子相應(yīng)的受體阻制劑也不能影響視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的再生過程[2]，提示神經(jīng)營養(yǎng)因子不是促進(jìn)長時(shí)程再生的關(guān)鍵因子。

本實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)錄組測序中，主成因分析顯示：對照組和視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)聚集，而晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組數(shù)據(jù)與它們離散，說明晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷大鼠模型具有不同于其它各組的基因差異表達(dá)模式，且晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的PC1為 94.83%，在成因分析中所占比例最大，是基因表達(dá)變化中的主要因素。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組，高表達(dá)的差異基因主要富集在細(xì)胞因子反應(yīng)、白細(xì)胞淋巴細(xì)胞和正向免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)過程，這說明炎癥反應(yīng)可能參與了晶狀體損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)損傷長時(shí)程再生過程。既往研究也發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)有促進(jìn)視神經(jīng)再生的作用[14]，與我們的結(jié)論一致。

MMP-12在生理狀態(tài)下參與胚胎形成、新生血管的形成及傷口的愈合[15]，在病理狀態(tài)下參與組織重構(gòu)、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、惡性腫瘤轉(zhuǎn)移、動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)和急性冠脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)的病理進(jìn)程[16-17]；MMP-12能降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)及血管壁成分，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲及轉(zhuǎn)移，而且MMP-12還能激活其它MMPs從而促進(jìn)水解過程[18]；MMP-12具有促髓鞘再生作用，它能誘導(dǎo)胰島素樣生長因子1/胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白6復(fù)合體中釋放具有活性的胰島素樣生長因子從而促進(jìn)髓鞘形成并成熟[19]，MMP-12基因敲除小鼠表現(xiàn)出少突膠質(zhì)細(xì)胞成熟和髓鞘形成延遲，降低小膠質(zhì)細(xì)胞遷移活性并促進(jìn)它的成熟，可以減緩星形膠質(zhì)細(xì)胞病，有利于軸突再生[20]。有研究也發(fā)現(xiàn)在NgR基因敲除的大鼠若同時(shí)存在眼內(nèi)炎癥，視神經(jīng)軸突再生會(huì)增強(qiáng)[21-22]；而炎癥浸潤細(xì)胞，如：巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，是在炎癥促進(jìn)視神經(jīng)再生過程中起到調(diào)控作用的主體[23-24]。

我們結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，對晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷的SD大鼠視神經(jīng)損傷區(qū)域組織進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)，檢測MMP-12 mRNA的表達(dá)變化。晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組的MMP-12 mRNA，在14、21d時(shí)表達(dá)顯著上調(diào)，而在7、28d時(shí)，無升高。ELISA結(jié)果提示晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷組在第7、14、21d時(shí)，MMP-12的蛋白質(zhì)表達(dá)顯著升高，但在28d時(shí)，各組間表達(dá)無差異。提示晶狀體損傷聯(lián)合視神經(jīng)損傷后的視神經(jīng)長時(shí)程再生伴隨有MMP-12的表達(dá)上調(diào)。既往研究提示MMP-12和MMP-9表達(dá)有促進(jìn)視神經(jīng)損傷的再生作用[25]，未有文獻(xiàn)報(bào)道MMP-12在視神經(jīng)長時(shí)程再生過程中的表達(dá)規(guī)律。

因此，我們認(rèn)為MMP-12的表達(dá)上調(diào)可能參與晶狀體損傷誘導(dǎo)視神經(jīng)鉗夾損傷后軸突長時(shí)程再生過程，但MMP-12發(fā)揮促軸突再生可能是綜合作用的結(jié)果，其機(jī)制需要進(jìn)一步研究探討。