蝴蝶蘭組織培養技術要點分析

張 婷

(廣東省惠州市農業科學研究所，廣東 惠州 516000)

本文研究了蝴蝶蘭組織培養的相關技術，通過實驗論證了在散射光環境下幼葉誘導蝴蝶蘭原球莖能夠達到最佳效果。最佳培養基為MS+6-BA6毫克/升水解乳蛋白500毫克/升+蔗糖5克/升（pH=5.4）；最適增殖培養基為MA+6-BA2毫克/升+NAA1毫克/升+水解乳蛋白500毫克/升+蔗糖25克/升+瓊脂5克/升（pH=5.4）；最適生根長苗培養基為1/2MS+IBA1.5毫克/升+NAA0.05毫克/升+0.3%活性炭+蔗糖25克/升+瓊脂5克/升（pH=5.4）。

1 蝴蝶蘭組織培養技術的注意事項

1.1 培養基添加物對蝴蝶蘭增值與分化的影響

一般可以在蝴蝶蘭組織培養中添加適量天然物質，能夠供給蝴蝶蘭幼苗微量營養成分、生長激素等，像是在其中加入120毫克/升香蕉泥，就能夠對原有pH值進行緩沖，以此達到壯苗與生根作用。相關資料指出，在培養基中加入適量椰乳或香蕉泥，能夠促進原球莖的增值。在蝴蝶蘭叢生芽中加入一定的添加物，能夠促進和誘導幼苗生根。而在其內加入高濃度活性炭，能夠促進原球莖增值。

1.2 原球莖繼代中褐化的防治

蝴蝶蘭與其他蘭科植物類似，原球莖狀體在繼代培養過程中易褐變死亡，很難增值。通過將1克/升活性炭加入到培養基中，并在合適時間內將原球莖褐化的部分進行切除，并重新配置新鮮的培養基，防治外植體出現褐變死亡，將10%椰子水加入培養基中，能夠讓原球莖更快生長，在其增值環節中有效抑制褐變現象。

2 蝴蝶蘭組織培養技術分析

2.1 實驗材料

大紅品系的3～4月齡蝴蝶蘭幼苗。

2.2 試驗方法

第一，清洗消毒外植體。取蝴蝶蘭植株幼葉（生長齡分別為2周、4周）與氣生根尖，用自來水清洗。在試驗工作臺絕對干凈的環境下，將葉與根尖置入無菌瓶中，用75%酒精消毒半分鐘，之后利用無菌水重復清洗3次，再將其浸泡在0.1%升汞溶液中，持續10分鐘，再用無菌水重復沖洗4次，結束后放置待用。第二，原球莖的誘導。將幼葉切塊，每塊規格4毫米×4毫米，長根尖規格為8毫米，使用極性接種方式，培養基選擇MS，加入NAA1毫克/升激素與不同濃度BA（1毫克/升、2毫克/升、4毫克/升L、6毫克/升）配比的誘導培養基，所要比較的光照環境為散射光與2000勒克斯兩種，每瓶要完成一個接種工作，處理10瓶后，重復操作3次。2個月后對不同外植體在不同培養基中原球莖的誘導率與生長狀態進行觀察總結。第三，原球莖增殖。在MS培養基中以5個為單位將原球莖接種到其中，并在其內加入NAA1毫克/升激素與不同濃度BA（1毫克/升、2毫克/升、4毫克/升、6毫克/升）配比的增殖培養基。2個月后，對原球莖所得到的增殖倍數以及原球莖大小進行統計。在上述培養基中加入500毫克/升水解乳蛋白，5克/升瓊脂以及25克/升蔗糖，pH值5.4，培養條件均為26℃，光照時間18小時，光照強度2000勒克斯。

2.3 壯苗與生根

將培養基所產生的蝴蝶蘭小苗轉接到各生根培養基中，每瓶3株，待10瓶完成后，上述流程重復3次，在30天后對苗生根率以及生長狀態、平均生根率進行統計。在生根培養基中加入0.3%的活性炭+蔗糖25克/升+瓊脂5克/升，培養條件均26℃，光照時間18小時，光照強度2000勒克斯。

3 結果與分析

3.1 不同外植體誘導原球莖的差異

以蝴蝶蘭根尖、幼葉（分別為2周、1個月）的葉來展開誘導原球莖的實驗。誘導率最高為38%，褐變率最低為6%。成熟葉難以產生較高的誘導率，且褐化嚴重到39%。蝴蝶蘭根尖未誘導出原球莖。從結果上看，幼葉生長齡在2周的更容易產生原球莖。而就相同葉片來說，葉基部較葉中和葉尖的切塊能產生更高的誘導率。幼葉如果尺寸較小，即使不切割也能夠達到原球莖誘導的目的。

3.2 不同濃度的BA對原球莖誘導的影響

以大小在2厘米左右、生長齡在一周、色澤嫩綠的葉片做誘導材料。在做好滅菌處理后將其中的原球莖接種到不同濃度的BA培養基中。在培養到15～20天發現葉片被切割周圍產生鮮綠色的原球莖狀小突起，和快發育成原球莖。

從表1看，BA培養液在不同濃度的情況下會對原球莖誘導率與大小造成較為明顯的影響。隨著2毫克/升的BA濃度上升到6毫克/升的BA濃度，最高誘導率為37.33%，高濃度BA對原球莖的誘導有著促進作用。但原球莖直徑會隨著濃度的增大呈現由小到大再由大到小的趨勢。BA6毫克/升時存在最大原球莖直徑3.5毫米，BA10毫克/升時存在最小原球莖直徑1.6毫米。

表1 不同濃度6-BA對原球莖誘導的影響

4 不同光照條件對原球莖誘導的影響

在誘導原球莖的操作階段，外植體容易產生褐化現象，為能做好褐化問題的防治工作，需要頻繁更換培養基，通常每10天更換一次，在培養基更換過程要避免葉片被放置過長實踐，以此降低褐化程度。在培養過程中，可發現光照強弱也會影響到褐化程度，當達到2000勒克斯的光照前度后，會產生很嚴重的褐化現象，褐化程度將達到40%；如果光照是由其他培養架反射的弱散射光而形成，將能夠較好的抑制褐化現象，褐化程度只有10%。

5 不同濃度BA對原球莖增殖與誘導出苗的影響

將所誘導的原球莖接種到增殖培養基中來實行增殖培養。通過表2可以看出，BA在不同濃度時對原球莖大小存在較為明顯的影響。濃度增加，原球莖增殖配屬也將增加，而原球莖大小成先升后降趨勢。當BA濃度為6毫克/升時，能夠達到最高原球莖增殖倍數6.8，原球莖最小為1.7。而在增殖的過程中還會生成許多叢生芽。如果BA濃度降低，當其為2毫克/升，原球莖將減小增殖倍數。

表2 不同濃度6-BA對原球莖增殖和生長的影響

但生成的原球莖多而粗壯，因而最佳BA濃度為2毫克/升。

6 原球莖的生根壯苗

在小苗增殖后將其接種到生根壯苗培養基中，可以得到結果，基本培養基為1/2MA，NAA為0.05毫克/升，IBA為1.5毫克/升時，苗的生根率達到最高500%，且苗的生長勢最健壯。

7 結束語

通過實驗可以發現，光照條件、外植體個數、BA濃度的不同，都會對原球莖的誘導產生影響，葉基部的切塊較葉中和葉尖的誘導率更高，通過切割葉片時，如果切口過多，會導致葉片加快褐化死亡。因此在切割葉片的過程中，應從葉基部進行切割，以此提高誘導率。在實驗中可以發現，BA濃度增加，能夠提高原球莖增殖率，同時即使不加BA，原球莖也能實現增殖，大概率是因為原球莖體內以存在一定的細胞分裂素。在生根壯苗培養環節，2/1MS能夠產生更好的效果。