基于網絡藥理學和生物信息學的黃楊堿抑制腎癌細胞的作用機制及實驗驗證研究

馬旭東，楊進，陳林，吳波，李嘉，王威威，梁國標

1.遵義醫科大學，貴州 遵義 563000；

2.成都大學附屬醫院泌尿外科，四川 成都 610081；

3.郫都區人民醫院泌尿外科，四川 成都 611730

腎細胞癌是泌尿系統最常見和最具風險的腫瘤之一，約占全世界所有確診癌癥數的5%[1]，主要發生在男性中[2]。并且在未來幾年中，腎細胞癌(renal cell carcinoma，RCC)的發病率和死亡率仍將繼續攀升，至2040年全球腎癌死亡人數估計高達30多萬[2]。腎細胞癌可以被分為不同的分子和組織學亞型[3]，透明細胞癌、乳頭狀腎細胞癌和嫌色細胞癌是腎細胞癌中最常見的亞型(≥90%)，而剩余的亞型≤10%。重要的是，每種亞型在預后和治療方面都具有特異性[4]。由于缺乏早期癥狀，大量腎細胞癌患者在發現時已有遠處轉移，手術治療困難。因此，藥物治療對于大多數腎細胞癌患者非常重要。

近年來，隨著科學技術的進步和國內外研究者的不斷努力，不斷涌現出許多有潛力治療腎細胞癌的新療法，例如針對哺乳動物雷帕霉素靶點(mTOR)和蛋白酪氨酸激酶(RTK)信號的靶向治療[5]。最近，基于免疫治療的新策略也被開發出來，旨在針對癌癥免疫細胞之間的相互作用(免疫檢查點抑制劑)，這種方案在RCC治療中取得了一些成功[6]。雖然使用免疫治療的患者生存率明顯高于單獨化療，但總體預后仍較差。因此，醫學界迫切需要找到一種新的、有效的抗腎細胞癌的藥物。

有證據表明，一些天然產物有確切的治療作用，如抑制細胞增殖、誘導凋亡、促進線粒體損傷、促進氧化應激等[7-8]。黃楊堿(cyclovirobuxine D，CVB-D)是一種生物堿，來源于中國黃楊和其他同屬植物。已發表的研究表明，CVB-D能通過CTHRC1-AKT/ERK-Snail信號通路抑制結直腸癌的發展[9]。此外，CVB-D在胃癌細胞、乳腺癌細胞中都有一定的抑制作用[10-11]。目前CVB-D的抗癌作用和詳細機制較為復雜，而CVB-D對腎癌的具體作用及機制尚不明確，故本研究希望進一步探索CVB-D對腎癌的作用機制。

1 材料與方法

1.1 網絡藥理學與生物信息學分析

1.1.1 CVB-D的預測靶點從PharmMapper(http://www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/)數據庫篩選CVB-D的潛在治療靶點?；蚍柮Q在UniprotKB數據庫(https://www.UniProt.org/)中手動規范化。

1.1.2 腎癌的潛在靶基因腎癌相關的靶基因來自DisGeNET(https://www.disgenet.org/)。搜索策略:設置關鍵字為“renal cell carcinoma”，物種確定為智人。

1.1.3 蛋白互作網絡構建為了闡明黃楊堿藥物作用靶點與腎癌靶點之間的相互作用，使用Venny 2.1.0在線軟件(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)獲得交集基因并繪制Venn圖。然后將交集靶點基因提交到STRING 11.0數據庫(https://STRING-db.org)，構建蛋白質-蛋白質相互作用(PPI)網絡模型，將生物物種設置為智人(Homo sapiens)，最小相互作用閾值設置為中置信度(＞0.4)。通過CytoScape(3.7.2)調整并作圖，再使用CytoHubba插件進一步分析網絡中的Hub基因。

1.1.4 富集分析使用基因本體論(GO)分析和京都百科全書(KEGG)通路富集分析來探索交集基因的生物學途徑和潛在的功能。將交集靶點基因分別輸入到DAVID數據庫(https://david.ncifcrf.gov/)和KEGG數據庫(https://www.kegg.jp/)，限定物種為人，設置P＜0.05，分析主要的生物過程和代謝途徑，并進行富集分析，保存結果，并使用微生信(https://www.bioinformatics.com.cn)在線工具將數據可視化。

1.1.5 核心靶點基因生物信息學分析從癌癥基因組圖譜(TCGA)數據集(https://portal.gdc.com)獲得腎透明細胞癌的RNAseq數據(level3)和相應的臨床信息。GTEx數據來自V8版本(https://gtexportal.org/home/datasets)。使用R軟件v4.0.3進行統計分析。P＜0.05被認為差異具有統計學意義。并利用基因表達分析交互分析數據集(GEPIA,http://gepia.cancer-pku)進一步分析腎透明細胞癌患者總生存期(OS)與核心基因表達水平的相關性(P＜0.05，其他選項設置為默認值)。

1.2 實驗驗證

1.2.1 實驗材料和試劑人腎透明細胞癌細胞系786-O、Caki-1皮膚轉移癌細胞均購自中科院細胞庫，RPMI-1640培養基(Gibco)，胰蛋白酶(Biosharp)，胎牛血清(Gibco)，黃楊堿試劑(Med Chem Express)，CCK-8試劑盒和BCA試劑盒(ThermoFisher)，EGFR抗體(ABclonal)、AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K抗體(華安生物)、β-actin抗體(ABclonal)、鼠兔IgG二抗(華安生物)。

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1.2.2 細胞培養786-O和Caki-1細胞在添加10%胎牛血清，100 U/mL青霉素-鏈霉素混合抗生素的RPMI 1640培養基中培養，細胞均放置在37℃，5%CO2濕化培養箱中。

1.2.3 CCK-8增殖實驗將腎癌細胞系Caki-1和786-O以2×104細胞/mL的密度接種在96孔板(每孔100μL培養基)中。接種24 h后，用無水乙醇(對照組)和黃楊堿[20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L]分別處理腎癌細胞，每個濃度包括5個重復。24 h后吸去96孔板中培養基，并在每孔中加入混有10μL CCK-8試劑的100μL完全培養基，培養箱孵育4 h后用酶標儀在450 nm波長下讀取吸光度，測量細胞增殖和活力，以上實驗重復3次。

1.2.4 細胞克隆形成實驗用6孔板培養細胞，每孔接種1 000個細胞。細胞貼壁后，藥物干預24 h；然后，將細胞置于正常培養基中10 d。移去培養基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞兩次。加入通用組織固定劑15 min后取出。加入結晶紫染色液染色10～20 min，沖去染色劑，晾干后用手機拍照。計算細胞克隆的數量。

1.2.5 倒置熒光顯微鏡下觀察細胞形態學的變化取對數生長期786-O和Caki-1細胞，接種于6孔板內，貼壁培養24 h后，用黃楊堿30μmol/L、60μmol/L個濃度給藥，并設空白對照組，于24 h后使用倒置熒光顯微鏡觀察786-O和Caki-1細胞形態并拍照。

1.2.6 流式細胞術測凋亡按說明書測定細胞凋亡率。在60 mm培養皿中添加約2×105個細胞，并用黃楊堿(0μmol/L、30μmol/L、60μmol/L)不同濃度進行處理。處理24 h后，收集細胞，在300μL結合緩沖液中重懸，在4℃黑暗中用PI和Annexin V-FITC染色約30 min。結果用流式細胞儀分析。

1.2.7 Western blot檢測通路靶點蛋白質表達采用蛋白免疫印跡法(Western blot)檢測EGFR、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達。取對數生長期786-O、Caki-1細胞，以5×105個，2 mL完全培養基接種6孔板，貼壁培養24 h后棄去每孔中舊培養基，分別用黃楊堿(30μmol/L、60μmol/L)兩個濃度給藥，并設空白對照組，收集各組干預24 h后的細胞提取總蛋白，并用BCA法測定各組蛋白濃度，經凝膠電泳、轉膜、封閉后，孵育對應的一抗(1∶1 000)和二抗(1∶20 000)，顯影后用Image J軟件分析，并用目的蛋白灰度值/內參灰度值表示蛋白相對表達量。

1.3 統計學方法所有驗證實驗均至少進行3次，實驗的計量數據結果均以均數±標準差(±s)表示，所有的統計學分析都使用Graphpad Prism V9軟件進行。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 黃楊堿和腎細胞癌的靶向基因本研究從Pharm Mapper數據庫中獲得黃楊堿136個治療靶點。從DisGeNET數據庫收集的腎細胞癌靶點數量為2 084個。

2.2 構建PPI蛋白互作網絡與分析黃楊堿和腎細胞癌的靶點通過Venny 2.1.0取交集，獲得68個CVB-D治療腎細胞癌的預測靶點(圖1A)。PPI網絡由STRING v11.0構建，并用Cytoscape軟件進行可視化(圖1B)。該PPI網絡包括68個節點和465條邊，平均節點度13.7。圓形節點代表每個蛋白質，節點大小越大，度值越高。節點之間的直線表示兩種蛋白質之間的相互作用。線越粗，相互作用越強。Hub基因由cytoHubba插件計算。利用MCC、Degree方法計算出前10個Hub基因(圖1C、1D)，并將結果進行交集得到5個核心靶點基因為：ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC。

圖1 黃楊堿與腎細胞癌的交叉靶點分析Figure 1 Analysis of the intersection targets of CVB-D and RCC

2.3 GO和KEGG通路富集分析為了探究黃楊堿和腎細胞癌交集基因的生物學功能，本研究進行了兩種富集分析：(A)GO富集分析和(B)KEGG富集分析。黃楊堿主要參與的生物學過程包括信號轉導、凋亡過程的正向調控、細胞周期的正向調控等(圖2A)。分子功能主要集中在蛋白結合、ATP結合、鋅離子結合等方面(圖2A)。所涉及的主要通路有:癌癥通路、PI3K-AKT通路、前列腺癌、癌癥中蛋白聚糖、MAPK信號通路等(圖2B)。

圖2 黃楊堿與腎細胞癌交集靶基因的富集分析Figure 2 Enrichment analysis of target genes at the intersection of CVB-D and RCC

2.4 核心靶點表達與RCC的相關性分析在腎細胞癌中對ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC這5個核心靶點進行表達差異篩選和生存分析篩選，結果顯示5個核心靶點中EGFR在腎癌組織中表達增高最為顯著(圖3A)。生存分析篩選得出高表達AKT1與腎細胞癌患者生存時間密切相關(圖3B)。故推測EGFR可能與黃楊堿治療腎細胞癌的作用密切相關。

圖3 核心靶點的差異表達和預后分析Figure 3 Differential expression and prognostic analysis of Hub genes

2.5 黃楊堿對腎細胞癌786-O、Caki-1細胞活性及增殖的影響通過細胞活力測定評價黃楊堿對786-O和Caki-1細胞的毒性作用。與對照組相比，用黃楊堿(0、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L、100μmol/L、120μmol/L、140μmol/L)處理后腎癌細胞存活率顯著降低，且呈濃度依賴性(圖4A，786-O 24 h IC50：51.51μmol/L；Caki-1 24 h IC50：42.19μmol/L)。且黃楊堿能明顯抑制腎癌細胞的集落形成(圖4B)，說明黃楊堿具有明顯抑制腎細胞癌細胞的作用。

圖4 黃楊堿對腎癌細胞的抑制作用Figure 4 Inhibitory effect of CVB-D on RCC

2.6 黃楊堿對786-O和Caki-1細胞形態學的影響在顯微鏡下可觀察到，空白對照組腎癌細胞786-O、Caki-1正常增殖，形態飽滿，細胞間連接緊密。黃楊堿30μmol/L、60μmol/L組可見細胞數量明顯減少，細胞皺縮且變得圓滑，懸浮細胞數量明顯增多。提示黃楊堿對腎癌細胞有抑制作用，如圖5所示。

圖5 光鏡下觀察黃楊堿作用前后細胞形態的變化Figure 5 Morphological changes of cells observed under light microscope before and after treatment with CVB-D

2.7 黃楊堿能誘導786-O、Caki-1細胞凋亡根據網絡藥理學分析結果，發現黃楊堿可能參與誘導細胞凋亡，進而抑制腎癌細胞增殖。因此，本探究采用流式細胞術探究黃楊堿對腎癌細胞凋亡的影響。黃楊堿處理后786-O和Caki-1細胞早期和晚期凋亡增加(圖6A)，與網絡藥理學結果一致。此外，還研究了Bax/Bcl-2的表達，因為它們在細胞凋亡中發揮著重要作用。Western blot結果顯示黃楊堿處理腎癌細胞后，抗凋亡的Bcl-2表達降低，促凋亡的Bax表達增加(圖6B)，表明黃楊堿能促進腎癌細胞凋亡。

圖6 黃楊堿對786-O和Caki-1細胞凋亡的影響Figure 6 Effect of CVB-D on apoptosis of 786-O and Caki-1 cells

2.8 黃楊堿能抑制腎透明細胞癌中EGFR、p-PI3K、p-AKT的表達黃楊堿作用786-O和Caki-1細胞24 h后，與空白對照組比較，CVB-D處理組腎癌細胞的EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達明顯下調(圖7)，提示黃楊堿對EGFR、p-PI3K、p-AKT蛋白表達具有抑制作用。

圖7 Western blot檢測黃楊堿處理786-O和Caki-1細胞后EGFR、p-PI3K、p-AKT的表達Figure 7 Expression of EGFR,P-PI3K,and P-Akt in 786-O and Caki-1 cells treated with CVB-D detected by Western blot

3 討論

腎細胞癌是最常見的癌癥之一，通過手術治療，局限性腎細胞癌預后較好，但實際臨床工作中大多數患者在診斷時已是轉移性腎癌。轉移性腎細胞癌治療難度大，主要原因是耐藥、反應率低、預后差[5]，常規臨床治療效果不理想。因此，迫切需要找到新的治療方法和藥物。

黃楊堿具有多種生物活性，包括抗氧化、抗炎、抗腫瘤等。黃楊堿對多種癌癥都有抑制作用，包括結直腸癌[9]、胃癌[10]、乳腺癌[11]、肺癌[13]等。雖然許多研究都提出黃楊堿的抗腫瘤活性，但黃楊堿在腎細胞癌中的詳細機制尚未完全闡明。在本研究中，通過預測黃楊堿治療腎癌潛在靶點得到68個靶基因?；诰W絡藥理分析構建腎細胞癌與黃楊堿之間的蛋白互作網絡，獲得核心靶點基因ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC。生信分析結果顯示，EGFR在腎癌組織中高表達，ALB、IGF1、AKT1在腎癌組織中低表達；生存分析顯示AKT1低表達的患者總生存期較高表達患者短。這表明ALB、IGF1、AKT1、EGFR、SRC參與多種腫瘤發展和信號通路，也表明黃楊堿可能是通過作用于以上靶點從而對腎細胞癌發揮直接或者間接的調控作用。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)是ErbB家族酪氨酸受體激酶的成員之一，在促進細胞增殖、對抗細胞凋亡方面發揮著重要作用[14-15]。EGFR的擴增和突變已被證明是許多癌癥的驅動因素，如非小細胞肺癌[16]、腎癌[17]和基底樣乳腺癌[18]等。例如，Smith等[19]發現EGFR可能是hif-2α依賴性腫瘤發生的關鍵決定因素，也是VHL腎癌治療的可靠靶點。有報道稱，下調EGFR可促進腎癌細胞凋亡，抑制細胞的增殖[20]，且本研究中生物信息學分析表明EGFR在腎細胞癌中高表達，故推測黃楊堿可能通過調控EGFR靶點對腎癌細胞起抑制作用。

本研究首次利用網絡藥理學和生物信息學，具體分析了黃楊堿治療腎細胞癌的分子機制。GO和KEGG富集分析表明黃楊堿治療腎透明細胞癌的關鍵靶點主要涉及凋亡、增殖、自身磷酸化、炎癥反應等生物學過程和PI3K-AKT、MAPK、Rap1等信號通路。通過上述分析提示黃楊堿可能通過EGFR-PI3K-AKT通路誘導細胞凋亡在腎細胞癌中發揮作用。體外實驗進一步證實黃楊堿的確能抑制786-O和Caki-1細胞活力，促進細胞凋亡，且呈濃度依賴性，與網絡藥理學預測結果一致。此外，實驗發現黃楊堿處理后腎癌細胞系786-O和Caki-1中EGFR的表達降低且磷酸化PI3K、AKT表達降低。因此，本研究推測黃楊堿可能通過調控EGFR的表達抑制PI3K-AKT的磷酸化誘導腎癌細胞凋亡從而抑制腎癌細胞。當然EGFR具體通過什么機制調控PI3K-AKT通路還需要后續研究進一步驗證。

綜上，通過網絡藥理學、生物信息學分析和體外實驗驗證，對黃楊堿治療腎細胞癌的作用及機制進行預測和驗證，表明黃楊堿可能通過多靶點、多途徑調控腎細胞癌的進展。本研究，首次證實黃楊堿可能通過抑制EGFR-PI3K-AKT通路促進腎癌細胞凋亡，在腎細胞癌中發揮重要作用，為未來腎細胞癌的進一步研究提供新的思路。