甲基化與組蛋白修飾在股骨頭壞死中的機制及中醫藥干預進展

高宇鶴 徐西林 李志剛 赫龍 薛玉滿 張曉峰*

1.黑龍江中醫藥大學研究生院,黑龍江 哈爾濱150040 2.黑龍江中醫藥大學附屬第二醫院,黑龍江 哈爾濱150001

股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)是指由于各種病因誘發骨細胞壞死的一種常見疾病,病理過程為“病因導致骨缺血,進而細胞壞死,成骨細胞分化使骨修復,然而持續病因作用導致骨吸收大于骨生成,因此外力致使股骨頭塌陷”[1]。ONFH的發病機制尚不完全清楚,使其成為骨科難治疾病之一。存在很多學說來解釋ONFH的發病機制,例如骨髓間充質干細胞(BMSCs)成骨分化異常、脂代謝異常、骨質疏松及骨細胞凋亡學說等[2]。中國年增加5萬～10萬例SONFH患者,且該數字呈上升趨勢[3]。高發病率、高致殘率迫使人們急需尋找有效的治療方法。眾多研究證實,表觀遺傳修飾在調節骨壞死、凋亡和骨髓間充質干細胞分化方面起著重要作用,因此可能是潛在治療靶點。

表觀遺傳學在中醫藥領域的研究中,在2010年以前,年發文量不足5篇,之后逐年增多,2016-2018年,為發文量的高峰期[4]。中醫藥治療股骨頭壞死的療效明顯、創傷小,早期可減輕患者痛苦。因此,本文通過綜述表觀遺傳學中DNA、RNA甲基化、組蛋白在防治股骨頭壞死中的作用機制,以期為中醫藥防治ONFH提供足夠的理論。

1 DNA 甲基化與股骨頭壞死

DNA甲基化是指在DNA甲基化轉移酶的催化下,腺嘌呤或胞嘧啶通過共價結合S-腺苷甲硫氨酸(SAM)提供的甲基團,形成5-甲基胞嘧啶(5 mC)的過程[5-6]。在激素性ONFH中,激素可以誘導BMSCs中ABCB1基因過甲基化修飾,使P糖蛋白合成減少,然而降低其甲基化能恢復細胞功能[7]。地塞米松通過DNA甲基化調控BMSCs分化[8]。另外在酒精性ONFH中,114個位點中23個位點顯示高甲基化,并在OPG/RANKL/RANK基因中發現多個CpG位點處于異常甲基化狀態[9]。ONFH組BMSCs增殖能力降低與FZD1 基因的異常CpG島高甲基化相關[10]。王鵬等[8]在中晚期時使用地塞米松干預BMSCs后,發現DNA甲基轉移酶1與H3K27 me3增加、H3K4me3減少有關。

10-11易位蛋白(ten-eleven-translocation protein,TET)酶家族在DNA去甲基化過程中起到關鍵調控功能,促使DNA主動去甲基,5 mC在TET酶的不斷氧化下,依次形成5hmC、5fC、5caC產物[11-12]。另外5hmC在激素性ONFH組上調,并且TET3通過影響5hmC水平,進而改變骨細胞凋亡[13]。研究認為激素性ONFH是一種多基因病,3個關聯基因NR3C1、MTHFR和IGFBP3與DNA甲基化存在交互作用[14]。

2 組蛋白修飾與股骨頭壞死發病機制

與DNA結合形成核小體的組蛋白是構成染色質的結構蛋白,通常經過乙酰化、甲基化、磷酸化、腺苷酸化等對組蛋白進行修飾[15]。

2.1 組蛋白去乙酰化修飾與股骨頭壞死

組蛋白去乙?；扇ヒ阴；?HDACs)催化,促進核小體及其周圍DNA的相互結合,繼而使基因轉錄發生沉默。哺乳動物中包含4類HDACs,其中Ⅰ類為HDAC1、2、3和8;Ⅱ類包括HDAC4、5、6、7、9和10;第Ⅲ類又稱沉默信息調節因子2相關酶類(Sir2-related enzymes,Sirtuins);Ⅳ類HDACs主要是HDAC11。其中Sirtuins家族包括SIRT1～7,均以一個輔助因子NAD+為結合域與核心催化結構域相構成[16]。

研究發現SIRT3在激素處理的BMSCs中降低[17],用花青素和白藜蘆醇處理成骨細胞時通過增加 SIRT1與SIRT3減少細胞凋亡[18]。SIRT6通過促進成骨分化從而預防股骨頭壞死[19]。過表達SIRT6的小鼠在缺血性手術后抵抗骨細胞死亡,而SIRT6敲除表現出加重的骨質流失和嚴重的畸形。另外在股骨遠端骨骺發生缺血性損傷后,SIRT6靶向維生素D受體(VDR)-RANKL通路對預防ONFH至關重要[20]。用SIRT6治療的髓系細胞中,骨缺血壞死手術中誘導的炎癥反應可能會減少[21]。

C/EBPα與成脂有關,實驗證明C/EBPα通過PPARγ通路促進BMSCs的成脂分化,具體機制是C/EBPα通過抑制 HDAC1上調PPARγ啟動子區域的H3K27乙?；?阻止脂肪分化,從而減緩激素性ONFH 的進展[22]。HDAC9與ONFH的成骨相關信號通路有關,在臨床上發現激素性和酒精性ONFH患者HDAC9c-S水平顯著上調[23]。當敲低HDAC9后發現,經過MAPK 信號通路抑制hBMSC的成骨分化[24]。另外下調HDAC9將誘發 BMSCs的成骨及成血管能力降低,成脂能力升高[25]。成骨分化降低導致低骨量,而低骨量與骨特異性基因啟動子的 H3K27乙?；瘻p少有關[26]。

2.2 組蛋白去甲基化修飾與股骨頭壞死

組蛋白去甲基化酶可根據特殊結構域的不同分為兩類:一個是具有Tower結構域的組蛋白去甲基化酶家族(lysine-specifichistone demethylase,LSD);另一個含Jumonji C(JmjC)結構域。后者為已知最大的一類組蛋白去甲基化酶,并根據不同結構域分為KDM2、3、4、5、6、7亞家族[27]。

研究證明KDM4A 的過表達促進了BMSC成骨分化[28]。在血瘀型激素性ONFH中,KDM6A mRNA減少[29]。KDM4A 直接結合 Sfrp4和C/ebpα的啟動子,去除組蛋白甲基化標記 H3K9me3,并降低二者啟動子區域CpG的DNA甲基化水平[30]。

KDM5家族是一個重要的表觀遺傳狀態修飾酶家族,包含5個保守結構域:JmjN、ARID、JmjC、PhD 和一個 C5HC2 鋅指[31]。包括KDM5A、KDM5B、KDM5C、KDM5D。KDM5A是BMSCs成骨分化的負調控因子,KDM5B作為一種成骨、成肌細胞分化的負調控因子參與Runx2的雙位點表觀遺傳調控[32]。

KDM5D是一種男性特異性蛋白[33]。在腎虛血瘀型激素性ONFH大鼠中發現沉默KDM5D基因導致BMSCs中Runx2、OPN、OCN降低[34]。KDM5D在人類成年男性神經嵴衍生干細胞(NCSC)分化時高度上調,使 H3K4me2/H3K4me1去甲基化。并且與女性NCSC相比,KDM5D是男性NCSC更快成骨分化的主要驅動因素,若KDM5D 的藥理學抑制顯著降低了雄性成骨分化能力[35]。

系統性紅斑狼瘡(SLE)男性患者的Y染色體上的兩個基因KDM5D和RPS4Y1發生下調[36]。在存在SLE但無ONFH組發現KDM5D表達降低,而激素組與SLE組比較,差異表達倍數前20的基因包含KDM5D,說明激素明顯影響KDM5D[34]。與野生型小鼠相比,缺少Y染色體以及KDM5D功能喪失突變的小鼠在甲基化水平上沒有差異,因此Y染色體的遺傳變異影響常染色體區域的DNA甲基化水平[37]。綜上,已知SLE患者會在臨床上大量使用激素會導致ONFH,而ONFH的男性患病率又高于女性,可能男性ONFH易感性與KDM5D的高水平有關。

KDM6A與骨細胞的生成有關,Xia等[38]證實表達骨基質酸性蛋白的成骨細胞/骨細胞中的組蛋白去甲基化酶(UTX,又稱KDM6A)通過H3K27 me3 修飾正向調節成骨細胞的分化。Wang等[39]證明UTX 減弱激素對成骨和成脂的失調,具體是減少Dkk1啟動子中的 Runx2啟動子甲基化和H3K27 me3富集,而β-catenin和Dkk1又可調節激素對UTX的抑制。UTX 抑制會加劇骨量丟失、骨小梁破壞和脂肪堆積。

2.3 組蛋白甲基化修飾與股骨頭壞死

H3K27 me3是常見的組蛋白甲基化修飾之一,具有轉錄抑制作用,與靶基因及mRNA的轉錄和翻譯呈負相關[40]。Zhang等[41]發現缺氧經過HIF-1α/EZH2信號軸促進LncRNA Tmem235啟動子H3K27 me3的修飾,抑制其表達,導致BMSCs缺氧凋亡。Bitirim等[42]證實經雌激素處理后脂肪形成相關基因的H3K27 me2和H3K27 me3增加可能是由雌激素受體α和組蛋白賴氨酸N-甲基轉移酶(EZH2)的直接相互作用介導的,雌激素調節 H3K27甲基化從而抑制MSC的脂肪分化,說明具有表觀遺傳轉換開關的作用。因此可以從表觀遺傳學上分析高齡女性易發生骨病的原因,隨著年齡增加,內源性雌激素水平下降,使抑制性的組蛋白修飾物減少,導致BMSC的脂肪分化不受抑制,最后導致骨細胞水平下降,骨含量減少,誘發ONFH。

3 RNA甲基化與股骨頭壞死

N6-甲基腺苷 (m6A) 是真核細胞中最豐富的RNA甲基化修飾類型,廣泛存在于真核細胞的mRNA和非編碼RNA中[43]。

Cheng等證明通過m6A使甲基轉移酶(METTL14)增加 PTPN6 mRNA 的m6A修飾,并增強穩定性,以此上調 PTPN6,進而加強METTL14對激素性ONFH的BMSCs的增殖和成骨分化[44]。

FTO是一種m6A去甲基化酶,并且研究發現FTO rs62033406 A>G是中國漢族人群ONFH的危險因素[45]。YTH家族中的YTHDF1蛋白主要通過與mRNA的m6A位點結合發揮作用[46]。FTO在骨質疏松癥和骨壞死患者中顯著下調,并且FTO 以YTHDF1依賴性方式介導 PPARG-mRNA 3'UTR 中的m6A去甲基化,并降低PPARG mRNA 穩定性,另外PPARG 的過表達會減輕FTO介導的BMSC成骨分化[47]。

4 中醫藥基于表觀遺傳學治療股骨頭壞死進展

4.1 中醫藥調控DNA甲基化治療股骨頭壞死

研究發現淫羊藿苷可能通過ABCB1啟動子去甲基化使類固醇相關性骨壞死患者的MSCs受益[48]。左歸丸使Runx2、Osterix、OC、β-catenin基因去甲基化從而促進BMSCs向成骨細胞分化[49]。葛根素抑制雌激素受體的啟動子甲基化及增加其mRNA表達從而促進成骨細胞增殖分化[50]。

4.2 中醫藥調控組蛋白甲基化治療股骨頭壞死

在調控組蛋白修飾方面,證明新橙皮苷(neohesperidin,NH)通過抑制 lncRNA-HOTAIR與lncRNA-SNHG1的組蛋白修飾來改善類固醇誘導的股骨頭壞死,NH增加了BMSCs的活力和HOTAIR與SNHG1的H3K27 me3占有率,但降低了二者的表達及H3K4me3的占有率[51-52]?；钛ńj膠囊通過抑制lncRNA-MIAT 改善股骨頭壞死,具體機制是由于顯著增加了MIAT啟動子區域中H3K27 me3的占有率并減少了H3K4me3[53]。毛殼素處理絨山羊脂肪間充質干細胞后可以顯著降低組蛋白H3K9 me2和H3K9 me3的甲基化修飾作用[54]。補腎健脾活血方促進組蛋白去甲基化酶JMJD2B的表達進而促進BMSCs成骨分化[55]。仙靈骨葆膠囊可通過抑制miR-100-5p的表達促進JMJD3/RUNX2通路的激活促進成骨細胞分化[56]。

4.3 中醫藥調控組蛋白乙?；委煿晒穷^壞死

白藜蘆醇可以在骨關節炎[57]、絕經后骨質疏松[58]中發揮促成骨作用,在股骨頭壞死中也不例外,大量實驗發現白藜蘆醇調控去乙酰化酶對不同種骨細胞,如(前)成骨細胞、(前)破骨細胞、間充質干細胞發揮作用。實驗證實白藜蘆醇通過增強 SIRT3 表達并降低大鼠的氧化水平,通過激活 AMPK/PGC-1α/SIRT3 軸促進BMSCs 成骨分化[17]。白藜蘆醇通過SIRT1激活至少部分地通過減弱 p44/p42 MAP 激酶通路來抑制 IGF-I 誘導的成骨細胞遷移[59]。白藜蘆醇通過提高SIRT1、Runx2、ALP等成骨因子的表達從而對前成骨細胞發揮骨保護作用[60]。白藜蘆醇通過上調SIRT1而增強成骨細胞的增殖,并抑制DEX誘導的成骨細胞線粒體自噬的發生[61]。白藜蘆醇通過激活導致成骨細胞分化的SIRT1和 Runx2 來反轉 TNF-β和NAM抑制的BMSCs成骨[62]。對于破骨細胞,白藜蘆醇通過激活Sirt1而上調FoxO1從而抑制破骨細胞的形成[63]。

蝦青素在乙醇處理的巨噬細胞中的抗炎和抗氧化特性可能至少部分是通過其對 SIRT1 和HDAC4的相反作用來介導的,從而使SIRT1能夠抵消乙醇誘導的HDAC4激活[64]。乙醇顯著降低了SIRT1 性和細胞NAD+水平,但蝦青素顯著減弱了RAW 264.7減少,并上調SIRT1[65]。水飛薊賓抑制氧化應激以促進成骨分化。此外證實通過激活SIRT1/SOD2信號通路促進MC3T3-E1的成骨分化[66]。藍莓汁部分通過 SIRT1 保護骨細胞和骨前體細胞免受氧化應激[67]?；罟枪嘧⒁嚎纱龠MSIRT1核轉移和LC3蛋白介導自噬泡形成使細胞自噬水平增加,拮抗地塞米松對BMSCs活力及成骨分化和鈣化的抑制作用[68]。巖白菜素可以促進骨髓間充質干細胞BMSC的成骨分化并抑制其成脂分化,RUNX2、COL1A1和SIRT1的表達水平顯著增加,PPARγ蛋白表達減少[69]。芫花素升高ALP、Runx2表達,下調HDAC1而促進MC3T3-E1向成骨細胞分化[70]。研究證實,姜黃素可作為表觀遺傳開關,通過抑制 EZH2 特異性調節成骨細胞分化,并顯著提高了成骨標志物的表達水平,包括 Runx2、Osterix、骨橋蛋白和骨鈣素[71]。海參腸肽(SCIP)顯著促進MC3T3-E1細胞的增殖和礦化結節,增加軟骨細胞向成骨細胞的分化。而SCIP 補充劑通過整合素介導的組蛋白乙?；T導軟骨細胞去分化為骨祖細胞,然后通過Wnt/β-catenin 信號轉導再分化為成骨細胞[72]。

4.4 中醫藥調控RNA甲基化治療股骨頭壞死

中藥小分子蟛蜞菊內酯可靶向結合RNA甲基化酶Nsun4,調控Nsun4的表達,進而調節RNA的m5C甲基化水平,促進BMSCs成軟骨分化[73]。墨旱蓮提取物升高BMSCs成骨分化過程中總RNA的m6A甲基化水平,促進了甲基化轉移酶METTL3、METTL4表達水平[74]。

5 總結與展望

綜上所述,表觀遺傳在ONFH對BMSC的成骨與成脂分化、血管生成,骨細胞凋亡、壞死等途徑發揮重要的調控作用。在臨床上通過采集ONFH患者壞死股骨頭組織、尿液樣本進行檢測分析,發現異常高DNA甲基化、組蛋白修飾、ncRNA等表觀遺傳修飾與ONFH的進程密切相關,這表明表觀遺傳的改變與ONFH成一定相關性。

雖然表觀遺傳學發展迅速,但基于此過程的治療多集中在動物模型尚未在臨床中推廣應用。隨著對股骨頭壞死發病機制中表觀遺傳學修飾的認識的不斷提高,希冀找尋一種新的表觀遺傳的臨床治療方法,從而達到抑制成脂分化、促進成骨分化、減少成骨細胞程序性死亡等目的。因此,更多的中醫藥實驗研究來詳細地描述表觀遺傳學在ONFH參與機制,并運用其實現臨床價值。