茶樹茉莉酸合成與轉導途徑關鍵基因在烏龍茶加工過程中對萜類物質的影響

盧麗，詹冬梅，周承哲,3，朱晨,3，謝思藝，徐凱，田采云，賴鐘雄，郭玉瓊*

1.福建農林大學園藝學院，福建 福州 350002；2.福建農林大學茶產業研究院，福建 福州 350002；3.福建農林大學園藝植物生物工程研究所，福建 福州 350002

茉莉酸類物質（Jasmonates，JAs）是重要的植物激素，在植物響應生物和非生物脅迫中具有重要作用[1-5]。當植物遭受到損傷時，植物體內的茉莉酸水平升高，激活植物防御相關的基因表達，進而提高植物逆境脅迫的防御能力[6-7]。茉莉酸合成途徑包括十六烷途徑和十八烷途徑[8-9]。其中，十八烷途徑始于亞麻酸（α-1inolenic acid，α-LA）被脂氧合酶（Lipoxygenase，LOX）氧化成13-氫過氧化亞麻酸（13-hydroperoxylinolenic acid，13-HPOT），再經丙二烯氧化合酶（Allene oxide synthase，AOS）及丙二烯環化酶（Allene oxide cyclase，AOC）氧化生成12-氧-二烯酸（12-oxo-phytodienoic acid，12-OPDA），經12-氧-二烯酸還原酶（12-oxophytodienoic acid reductase，OPR）作用，再經3次β-氧化后形成茉莉酸；茉莉酸通過茉莉酸-氨基合成酶（Jasmonic acid-amino synthetase，JAR）作用生成茉莉酸-異亮氨酸（Jasmonic Acid-Isoleucine，JA-Ile）[10-11]。茉莉酸信號轉導途徑，靜息階段植物體內有少量JA-Ile，茉莉酸ZIM結構域蛋白（Jasmonate ZIM-domain，JAZ）招募輔抑制因子（Topless，TPL）和NOVEL INTERACTOR（NINJA）共同形成三元復合物抑制轉錄因子（Myelocytomatosis2，MYC2）靶基因的表達，到轉運階段體內JA-Ile含量劇增，JA-Ile促進泛素連接酶復合體SCFCOI1與JAZ結合，使JAZ在26 S蛋白酶體的作用下降解，共激活因子（Mediator Subunit 25，MED25）和MYC2相互作用增強，進入激活階段，該過程中LEUNIG/LEUNIG HOMOLOG（LUG/LUH）能夠促進MED25和HAC1相互作用以及MED25和MYC2相互作用，最后激活MYC2靶基因表達，即茉莉酸應答基因表達[12-14]。

烏龍茶是我國六大茶類之一，具有馥郁的天然花果香[15]。萎凋和做青是烏龍茶加工的關鍵工序，對烏龍茶獨特風味的形成具有關鍵作用。在萎凋及做青過程中，茶葉會遭受紫外線輻射、機械損傷和失水等多種非生物脅迫。這些非生物脅迫可誘導茉莉酸積累，從而激活防御基因的表達，同時茉莉酸的積累對香氣形成具有重要作用[16-17]。研究表明，日光萎凋可誘導茉莉酸含量增加，促進萜類合成基因表達及萜類化合物積累[18]。做青過程中的連續損傷誘導茉莉酸生物合成相關基因的轉錄，使茉莉酸含量維持較高水平[19-20]，有助于激活香氣形成結構基因的表達[16]。林馨穎等[21]對茶樹LOX基因家族進行鑒定及分析，發現茶樹LOX基因家族部分基因在白茶萎凋過程中的某些時間點表達量上調，促進香氣物質形成；胡清財等[22]對茶樹COI1基因家族進行鑒定，其中，CsCOI1a在烏龍茶室內萎凋后表達量顯著上調，CsCOI1b在日光萎凋后表達量顯著上調，同時茉莉酸含量發生顯著變化。反式-橙花叔醇、α-法尼烯和芳樟醇等萜類化合物是烏龍茶中檢測到的主要香氣組分，具有特殊的天然花果香和獨特的韻味，香氣閾值低，在做青過程的機械損傷脅迫下大量形成[23-25]。而茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因在烏龍茶加工過程中對萜類物質形成的影響尚未見報道。

本研究對鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉和殺青前青葉進行實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測，利用頂空固相微萃取-氣相色譜質譜聯用（HS-SPME-GC-MS）技術測定萜類化合物相對含量，并引入香氣特性影響值（Aroma character impact，ACI）評估單個萜類化合物對烏龍茶香型的貢獻程度。同時，對鐵觀音鮮葉中茶樹茉莉酸合成途徑基因進行功能驗證，分析茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑基因表達量和茉莉酸含量及萜類物質相對含量之間的相關性，以期了解茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因與烏龍茶加工過程香氣形成機制，為基因應答脅迫的研究提供一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料與處理

試驗于2021年5月在福建省安溪劉金龍茶業有限公司生產基地進行。以鐵觀音茶樹品種一芽二、三葉為原料，采用閩南傳統鐵觀音加工工藝。主要工序包括鮮葉、萎凋、做青（一搖、二搖、三搖、四搖、殺青前攤放，做青房溫度23 ℃、相對濕度75%～85%）、炒青、揉捻、初培、復培、復包揉、文火慢烤、揀簸。按四分法取鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉及殺青前青葉進行液氮固樣，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測，每次取樣進行 3次生物學重復，樣品信息如表1所示。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

1.1.2 儀器與試劑

主要儀器：SPME固相微萃取裝置，美國Agilent公司；Allegra 64R臺式高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特公司；Light Cycler 480實時熒光定量聚合酶鏈式反應儀，美國羅氏公司；多功能酶標儀，奧地利Tecan公司。

主要試劑：RNA提取試劑盒，天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒，上海翌圣生物科技有限公司；Trans Zol UP試劑盒、Easy Script First-Strand c DNA Synthesis Super Mix試劑盒，北京全式金生物技術股份有限公司；ELISA試劑盒，上海酶聯生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 關鍵基因鑒定與組織特異性分析

從茶樹數據庫（http://tpia.teaplant.org）中下載茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因相關數據，使用擬南芥序列作為查詢序列，并結合其京都基因和基因組數據庫（KEGG）注釋獲取茶樹參與茉莉酸合成及信號轉導途徑的相關候選基因序列，再根據CDD網站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）及相關文獻對獲取的候選基因進行驗證。

從TPIA下載該途徑基因在不同器官（芽、嫩葉、成熟葉、老葉、花、果實、莖、根）特異性表達譜，以 log2（FPKM+0.1）轉換數據并利用TBtools軟件繪制表達熱圖。依據FPKM＜0.3、FPKM＞1、FPKM＞60分別對應基因表達較低或不表達、有表達、高表達，篩選出茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因家族在芽和嫩葉中FPKM＞1或FPKM＞60的基因。

1.2.2 啟動子順式作用元件預測

采用TBtools軟件提取茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑的關鍵基因轉錄起始位點上游2 000 bp序列作為啟動子區域；提交至 Plant CARE（http://bioinformatics.psb.ugen-t.be/webtools/plantcare/html）網站預測啟動子順式作用元件。篩選出茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因家族中含有茉莉酸響應元件（CGTCA-motif、TGACG-motif）、損傷響應元件（WUN-motif）和厭氧誘導元件（ARE）數量較多的基因進行熱圖可視化分析。

1.2.3 總RNA提取和qRT-PCR檢測

使用Trans Zol UP試劑盒分別提取鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉及殺青前青葉的總RNA，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA的完整性，使用紫外分光光度計檢查純度和濃度。采用Easy Script First-Strand c DNA Synthesis Super Mix試劑盒將OD260/OD280值在1.9～2.1的RNA逆轉錄為cDNA，用于qRT-PCR檢測分析，以β-actin作為內參基因，采用法計算基因的表達水平[26]，設置 3次重復，qRT-PCR擴增的特異性引物信息如表2所示。

1.2.4 茉莉酸含量測定

樣品溶液的制備：將鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉、殺青前青葉分別放入預冷的研缽中，按1 g樣品加入9 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）比例加入PBS，添加少量石英砂，冰浴研磨，勻漿液置于離心管，4 ℃，1 000 g離心20 min，取上清液待測。

茉莉酸含量的測定：采用酶聯免疫吸附測定法（ELISA，Enzyme-linked immuno sorbent assay）測定茉莉酸含量。室溫平衡20 min后取出板條，設置標準品孔、樣品孔和空白對照孔，按照試劑盒說明書的操作步驟進行，待反應完成后加入50 μL終止液，在15 min內用酶標儀測定450 nm處的吸光度。將樣品吸光值代入標準曲線回歸方程中，計算樣品濃度，再乘以稀釋倍數，即為茉莉酸的實際濃度。

1.2.5 茶樹茉莉酸合成途徑基因功能驗證

基于Liu等[27]的方法稍作修改，使用Soligo（https://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/soligo.pl）設計與CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1互補的反義寡核苷酸（AsODN）序列，以有義寡核苷酸（sODN）序列作為對照。先用葡萄糖水（80 μmol·L-1）將AsODN 和sODN序列稀釋至100 μmol·L-1，再稀釋5倍后備用。采摘鐵觀音茶樹嫩梢，保留一芽二葉，將其末端放入含有稀釋引物的1.5 mL微型離心管中，膠片密封，放置于光照培養箱（溫度24 ℃，濕度(75±5)%，光照周期為16 h光照/8 h黑暗）培養24 h后取出，液氮固樣，置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測。取第二片鮮葉參照1.2.3章節的方法進行總RNA提取和qRT-PCR檢測，參照1.2.4章節的方法進行茉莉酸含量測定。

1.2.6 萜類化合物測定

取烏龍茶加工過程鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉及殺青前青葉，進行真空冷凍干燥，置于干燥皿36 h，使用研磨機研磨成均質粉末，對應茶粉含水率分別為5.718%、5.563%、5.616%、5.569%和5.711%。參考Zhou等[28]方法，利用HS-SPME-GC-MS技術對烏龍茶加工過程中揮發性化合物進行檢測。

HS-SPME萃取方法：稱取1.000 g樣品于頂空瓶中，加入1 mL飽和NaCl溶液，采用HS-SPME進行樣本萃取。萃取條件：在100 ℃恒溫下，振蕩 5 min，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭（使用前萃取頭在 Fiber Conditioning Station中250 ℃下老化5 min）插入樣品頂空瓶萃取15 min，于250 ℃下解析5 min。

GC分析：色譜柱為DB-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），載氣N2≥99.999%，流速1.2 mL·min-1，進樣口溫度250 ℃，溶劑延遲3.5 min。升溫程序：40 ℃保持3.5 min，然后以10 ℃·min-1升至100 ℃，再以7 ℃·min-1升至180 ℃，最后以25 ℃·min-1升至280 ℃保持7 min。分流模式為不分流進樣。

MS分析：EI離子源，離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，電子能量70 eV，質譜接口280 ℃，掃描方式為選擇離子監測（SIM），定性定量離子精準掃描（GB 23200.8—2016）。

1.2.7 定性定量分析

基于MWGCSIM1.0數據庫及相關文獻[29]，用MassHunter定量軟件打開質譜文件，進行色譜峰的積分及校正，實現樣本代謝物質譜定性及相對定量分析。萜類物質相對含量計算公式如下：

式中，R表示相對含量，μg·kg-1；S1和S2分別表示目標峰面積和內標峰面積；m1表示樣本質量，kg；m2表示內標質量，μg。

1.2.8 ACI的計算方式

查閱文獻[30-31]及相關網站確定揮發性萜類物質的閾值，并進行ACI值計算，公式如下：

式中，Pi表示第i個揮發物的峰面積百分比；Ti表示第 i個揮發物在空氣中的閾值；k為揮發物總數量。

1.3 數據分析

用Excel 2013軟件對數據進行統計分析，數據均以平均數±標準差（±SD）表示；采用SPSS 25進行相關性分析，GraphPad Prism v6.01繪制柱狀圖，利用TBtools v1.046進行熱圖繪制和聚類分析。

2 結果與分析

2.1 茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因分析

從茶樹基因組中共找到11個茉莉酸合成與信號轉導途徑的基因家族，包含133個候選基因，按其在染色體上的排列順序命名，以log2（FPKM+0.1）轉換數據繪制表達熱圖，其中72個基因屬于茉莉酸合成途徑，包括18個LOX基因、3個AOS基因、5個AOC基因、7個OPR基因、15個ACX基因、12個MFP2基因和12個JAR基因（圖1A）；61個基因屬于茉莉酸信號轉導途徑，包括17個 COI1基因、7個JAZ基因、22個MYC2基因、11個TPL基因和4個LUG基因（圖1B）。

圖1 茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因不同器官表達譜Fig.1 Different organ expression profiles of key genes of jasmonic acid synthesis and signal transduction pathway in tea plants

為探究茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因在烏龍茶加工過程中表達模式，依據FPKM值以及順式作用原件預測結果，在芽和嫩葉中篩選到19個FPKM值較高且含有茉莉酸響應元件或脅迫響應元件較多的基因，包括CsLOX11（CSS0032783.1）、CsLOX12（CSS0033612.1）、CsAOS2（CSS0037941.1）、CsAOC1（CSS0006857.1）、CsOPR2（CSS0008148.1）、CsACX4（CSS0006548.1）、CsACX8（CSS0023687.1）、CsMFP2_6（CSS0020016.1）、CsJAR9（CSS0048352.1）、CsJAR12（CSS0026777.1）、CsCOI1_4（CSS0007560.1）、CsCOI1_12（CSS0022348.1）、CsJAZ4（CSS0022053.1）、CsJAZ7（CSS0031905.1）、CsTPL6（CSS0028710.1）、CsLUG4（CSS0049393.1）、CsMYC2_4（CSS0004820.1）、CsMYC2_15（CSS0037963.1）和CsMYC2_21（CSS0047466.1）。

2.2 基因啟動子順式作用元件預測分析

為探究茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因的潛在功能，對該途徑19個基因啟動子順式作用元件進行分析。結果顯示（圖2），19個基因的啟動子區域共具有19種順式作用元件，包括10個植物激素響應元件，其中茉莉酸響應元件最多，為CGTCA-motif和TGACG-motif；5個脅迫響應元件，損傷響應元件（WUN-motif）和厭氧誘導元件（ARE）較多；3個植物生長發育響應元件；1個次生代謝響應元件。

2.3 茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因表達量及茉莉酸含量分析

為探究茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因響應烏龍茶加工過程逆境脅迫及表達模式，采用qRT-PCR檢測該途徑19個關鍵基因的相對表達量。以采摘后鮮葉為對照，對該途徑19個關鍵基因經過萎凋、二搖、四搖、殺青前攤放4個過程后的表達模式進行分析（圖3B）。結果表明，CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsOPR2、CsACX8、CsMFP2_6、CsJAR9、CsJAR12、CsCOI1_4、CsJAZ7、CsMYC2_4、CsMYC2_15和CsMYC2_21等14個基因表達量均呈現二搖后升高、四搖后下降，殺青前回升的趨勢；CsCOI1_12、CsLUG4表達水平呈波動上升趨勢；CsACX4和CsJAZ4的表達水平呈現先上升后下降趨勢，在二搖后達到最高；CsTPL6表達量總體呈上升趨勢。

烏龍茶加工過程茉莉酸含量分析表明（圖3C），鮮葉經過萎凋后茉莉酸含量顯著增加，搖青過程中茉莉酸含量保持較高水平，第四次搖青后茉莉酸含量達到最高水平，殺青前的攤放使茉莉酸含量回落，但仍高于鮮葉中的茉莉酸含量。

圖3 茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因表達水平和茉莉酸含量Fig.3 Expression levels of key genes in jasmonate synthesis and signal transduction pathway and jasmonate content in tea plants

2.4 茶樹茉莉酸合成途徑基因的功能分析

LOXs、AOS和AOC等是茉莉酸生物合成途徑中的重要酶基因，在茉莉酸類化合物生物合成途徑中起著重要作用。為了進一步驗證茶樹茉莉酸合成途徑關鍵基因對茉莉酸合成的影響，使用AsODN抑制茶樹茉莉酸生物合成途徑中的關鍵酶LOX、AOS和AOC基因在鐵觀音鮮葉中的表達水平。結果表明，用AsODN處理的鮮葉中CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1的表達水平顯著低于對照sODN處理的茶葉，茉莉酸含量趨勢與 CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1表達趨勢一致（圖4）。以上結果進一步驗證烏龍茶萎凋和做青過程的連續損傷誘導了茉莉酸合成途徑關鍵基因的表達，促進茉莉酸積累。

圖4 茶樹茉莉酸合成途徑基因的功能驗證Fig.4 Functional verification of jasmonic acid synthetic genes in tea plants

2.5 烏龍茶加工過程萜類物質動態變化

為了解烏龍茶加工過程萜類化合物的動態變化，利用HS-SPME-GC-MS技術對烏龍茶加工過程中揮發性化合物進行檢測，并對鑒定篩選得到的萜類化合物進行分析。結果共鑒定出73種萜類化合物（表3），大多數萜類化合物的相對含量在鮮葉、萎凋葉、二搖后青葉、四搖后青葉和殺青前青葉5個樣品中存在顯著性差異，且多為花果香型物質。

表3 烏龍茶加工過程萜類化合物相對含量Table 3 Relative terpene contents during oolong tea processing

續表3-1

續表3-2

為更直觀地了解萜類化合物在烏龍茶加工過程中的變化情況，采用TBtools V1.046軟件對萜類化合物進行聚類熱圖分析（圖5），熱圖橫坐標代表萜類化合物，縱坐標代表不同加工過程茶樣，藍色表示萜類化合物含量比平均值低，紅色表示萜類化合物含量比平均值高，由圖5可知，萜類物質動態變化分為兩類，第一類包括反式-橙花叔醇、α-法尼烯和芳樟醇等47種萜類化合物，其含量隨加工過程的進行逐漸增加，主要在四搖以及殺青前攤放過程中含量最高；有研究表明，烏龍茶做青過程中α-法尼烯、橙花叔醇、反式-橙花叔醇和β-紫羅蘭酮等花果香型化合物增加，有利于烏龍茶特征香氣形成[32-35]。第二類包括月桂烯、香葉醇、檸檬醛等萜類化合物，其含量在鮮葉和萎凋葉中較高，在做青過程中逐漸減少。

圖5 烏龍茶加工過程萜類物質動態變化Fig.5 Dynamic changes of terpenoids during oolong tea processing

香氣化合物香氣貢獻程度與其含量的高低并不完全一致，還與其閾值密切相關[36-37]。對73種萜類化合物閾值進行相關文獻[38-40]及網站查閱，得到19種萜類物質閾值，并進行ACI值計算，結果如表4所示。其中，芳樟醇（花香、柑橘香）、香葉醇（花果香）、β-紫羅蘭酮（花果香）和檸檬醛（檸檬香）閾值低，ACI值高，說明這些物質對烏龍茶香氣貢獻度高。

表4 烏龍茶萜類化合物ACI值Table 4 ACI values of terpenoids in oolong tea

2.6 基因表達量、茉莉酸含量和萜類物質相對含量相關性分析

為探究茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因調控烏龍茶加工過程萜類物質形成機制，對該途徑基因表達量、茉莉酸含量和萜類物質相對含量進行相關性分析（圖6）。結果表明，基因表達量與茉莉酸含量之間，CsACX4、CsMFP2_6、CsCOI1_4、CsCOI1_12、CsTPL6、CsJAZ4和CsLUG4等7個基因的相對表達量與茉莉酸含量存在正相關。茉莉酸含量與萜類物質相對含量之間，茉莉酸含量與反式-橙花叔醇、α-法尼烯和紫羅蘭酮等44個萜類物質的相對含量呈正相關，而與香葉醇呈顯著負相關（P＜0.05），與檸檬醛呈極顯著負相關（P＜0.01）?；虮磉_量與萜類化合物相對含量之間，CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsACX4、CsACX8、CsMYC2-4、CsMYC2_15和CsMYC2_21等9個基因的相對表達量與β-蒎烯、檸檬烯、月桂烯等萜類物質相對含量呈正相關；CsOPR2、CsTPL6、CsLUG4和CsCOI1-12等基因的相對表達量與反式-橙花叔醇、α-法尼烯和紫羅蘭酮等萜類物質的相對含量呈正相關；CsAOC1與檸檬醛、(E)-3,7-二甲基-2,6-辛二烯醛呈顯著正相關，CsOPR2與鄰傘花烴呈顯著正相關（P＜0.01），CsCOI1-12與δ-欖香烯、(R)-4-甲基-1-(1-甲基乙基)-3-環己烯-1-醇呈顯著正相關（P＜0.01），CsTPL6與α-法尼烯、反式-橙花叔醇、紫羅蘭酮等35種萜類化合物呈極顯著正相關，與(+)-(E)-檸檬烯氧化物、茴香腦呈極顯著負相關（P＜0.01）。

圖6 基因表達量、茉莉酸含量和萜類物質相對含量相關系數熱圖Fig.6 Heat map of correlation coefficient of gene expression,jasmonic acid content and relative content of terpenes

3 討論與結論

3.1 茉莉酸合成與信號轉導途徑基因響應烏龍茶加工過程中多種脅迫

茉莉酸是一類重要的廣譜應激激素，在響應外界各類脅迫中發揮著重要作用[41]。本研究在茶樹基因組中共分析得到133個茉莉酸合成與信號轉導途徑候選基因，并對芽和嫩葉上FPKM值表達較高且含有茉莉酸響應元件或脅迫響應元件較多的19個基因進行分析。順式作用元件預測發現，該途徑19個基因含有大量激素和脅迫響應元件，包括茉莉酸響應、損傷響應、厭氧誘導等元件。研究表明，植物受到干旱、低溫、機械損傷等非生物脅迫會導致茉莉酸和JA-Ile的積累，從而激活防御基因的表達[42-43]。因此，本研究對茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑中的基因在烏龍茶加工過程中的表達模式進行分析，發現該途徑基因響應烏龍茶加工過程中的多種脅迫且表達模式不同，茉莉酸含量在此過程中大量積累。CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsOPR2、CsACX8、CsMFP2_6、CsJAR9、CsJAR12、CsCOI1_4、CsJAZ7、CsLUG4、CsMYC2_4、CsMYC2_15和CsMYC2_21等15個關鍵基因在萎凋、二搖、四搖和殺青前攤放4個過程表達模式呈N字型，且多數基因在二搖后達到最高水平。第四次搖青后基因顯著下調，可能與葉片經過幾次搖青損傷失水后造成RNA降解，導致基因轉錄豐度降低有關。其中，LOXs、AOS和OPR2等是茉莉酸生物合成途徑中的重要酶基因，陳壽松[44]研究發現，LOX、AOC、OPR和ACX等基因在烏龍茶日光萎凋處理15 min時顯著上調，而在日光萎凋處理30 min和60 min時呈現下調表達。本研究日光萎凋處理23 min，CsLOX11和CsACX4顯著上調，CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsOPR2和CsACX8等5個基因顯著下調，在二次搖青時7個基因均呈上調趨勢。通過對茶樹茉莉酸生物合成途徑中的關鍵酶LOX、AOS和AOC基因進行功能驗證，發現茉莉酸含量與CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1表達趨勢一致，烏龍茶加工過程中，大多數茉莉酸合成途徑關鍵基因在二搖后達到最高，說明二次搖青是茉莉酸合成的主要時期。TPL是一類保守的植物轉錄輔抑制因子家族蛋白[45]，可參與植物非生物脅迫響應以及茉莉酸信號轉導[46]。本研究中，CsTPL6在烏龍茶加工過程中呈上升趨勢，其表達量與茉莉酸含量呈正相關，表明CsTPL6在茉莉酸信號中被積極調節，與An等[47]研究一致。MYC2是茉莉酸信號轉導途徑中最核心的轉錄因子，在控制創傷誘導的茉莉酸積累方面起核心作用[48-49]，茶樹MYC2響應外源茉莉酸脅迫處理以及干旱脅迫處理，預示MYC2參與茶樹的各種非生物脅迫響應[50]。本研究發現，CsMYC2_4、CsMYC2_15和CsMYC2_21在萎凋和做青過程表達模式不同，但均在二次搖青后表達量達到最高，表明在響應機械損傷脅迫方面較為突出。綜上所述，茶樹茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因可響應烏龍茶加工過程中多種脅迫，茉莉酸在響應烏龍茶加工過程的脅迫中發揮著重要作用，其中，二次搖青是茉莉酸合成的主要時期。

3.2 茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因與烏龍茶萜類物質形成相關

萜類化合物是植物遭受逆境脅迫影響后產生的通訊信號，提示植物啟動防御系統，以此減輕脅迫帶來的負面影響[51]。有報道稱茉莉酸可以作為一種激活劑，通過促進萜類化合物的合成來改善植物的香氣[19,35]。此外，當植物受到脅迫時，與萜類化合物合成相關的基因表達水平增加，萜類化合物的含量增加[52-53]。本研究通過對鐵觀音鮮葉進行基因功能驗證，茶樹茉莉酸合成途徑中CsLOX11、CsAOS2和CsAOC1的表達趨勢與茉莉酸含量趨勢一致，而在烏龍茶萎凋和做青處理后，茉莉酸合成途徑中LOX、AOS、AOC和ACX上調表達，茉莉酸含量顯著上升。因此，烏龍茶加工過程可促進茉莉酸大量積累，而高含量的茉莉酸通過茉莉酸信號轉導途徑的基因激活下游萜類化合物的合成，進而促進萜類化合物的積累。在萎凋葉和二搖青葉中，JAR和COI1上調表達，通過傳遞上游的茉莉酸信號，啟動SCFCo11進行JAZ的識別捕獲，被捕獲后的JAZ在26 S蛋白酶體作用下降解，從而抑制了JAZ的正常表達。隨后，JAZ對MYC2的抑制作用被解除，促進了萎凋及二搖中MYC2轉錄水平的大幅上升。研究表明，高表達的MYC2可增強萜類合成酶（Terpene synthase，TPS）的轉錄水平，進而促進萜類化合物的積累[54]。本研究結果表明，萎凋和做青處理激活茉莉酸信號轉導途徑關鍵基因表達，進而促進了萜類化合物積累，與前人結果一致[55]，其中第二次搖青多數基因表達量達到較高水平，是茉莉酸合成的主要時期。本研究通過相關性分析驗證茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因與萜類物質含量變化的關系，發現該途徑關鍵基因CsLOX11、CsLOX12、CsAOS2、CsAOC1、CsACX4、CsACX8、CsMYC2-4、CsMYC2_15、CsMYC2_21等與β-蒎烯、檸檬烯、月桂烯等萜類化合物呈正相關；CsOPR2、CsCOI1-12、CsTPL6、CsLUG4與反式-橙花叔醇、α-法尼烯、紫羅蘭酮等相對含量呈正相關。其中，CsTPL6與35種萜類化合物存在極顯著正相關，這些萜類物質在殺青前攤放過程含量較高，主要呈花果香，說明TPL輔抑制活性在茉莉酸信號中被積極調節，對萜類化合物的形成具有重要作用。同時，本研究中芳樟醇、香葉醇、β-紫羅蘭酮和檸檬醛等花果香型物質閾值低，ACI值較高，對烏龍茶花果香香氣貢獻度較大。因此，茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因與烏龍茶萜類物質形成相關，特別是呈花果香型物質。

綜上所述，本研究揭示了烏龍茶萎凋和做青過程的連續損傷可誘導茉莉酸合成與信號轉導途徑關鍵基因的表達，促進茉莉酸積累，以及該途徑基因參與調控烏龍茶加工過程中萜類化合物形成，為探明烏龍茶加工過程香氣形成的分子機制奠定基礎。