蟬花菌質在飼料中應用的安全性研究

紀 偉， 蘇文英， 劉曉梅， 柴文波*， 任立凱*， 閆文娟， 孫長勝， 陳克龍

（1.連云港市農業科學院，江蘇連云港 222000；2.青海師范大學，青海西寧 810000；3.浙江泛亞生物醫藥股份有限公司，浙江嘉興 314200）

蟬花（IsariacicadaeMiquel）是一種古老的蟲草，具有豐富的營養價值（李增智等，2020；劉愛英，2012）。蟬花子實體（人工培植）采收后剩余的培養基，在發酵過程中，培養基大部被分解轉化，里面含有部分蟬花蟲草菌絲體，故命名為蟬花菌質（紀偉等，2021）。研究表明，蟬花菌質不僅含有腺苷、多糖等活性成分，還含有豐富的氨基酸、微量元素、D-甘露醇和核苷類、維生素類、蕈糖和硬脂酸等物質（于士軍等，2015；于士軍等，2014），具有廣泛的藥理作用（孫長勝等，2020）。開發應用這部分資源，不僅為蟬花子實體收獲后留下的材料解決了出路問題，而且可變廢為寶，提高蟬花培養物的附加值（昆都孜斯坎達爾等，2019）。

蟲草作為飼料原料或飼料添加劑應用于養殖業逐漸成為研究熱點，尤其是我國農業農村部第194號公告發布后，“減抗、替抗、無抗”轉型升級已是大勢所趨。蟲草飼料添加劑屬真菌類發酵產物，天然、無耐藥性、無毒副作用、無殘留，是一種新型的免疫增強劑，符合添加劑或飼料原料市場綠色、環保的發展要求，可作為免疫增強類飼料添加劑或飼料原料應用于畜禽毒性疾病的防治中，對我國實施的生態養殖和健康養殖具有非常重要的意義（紀偉等，2021；李洋等，2019）。

本研究擬對大鼠連續染毒90 d，通過分析受試大鼠的食欲、飲水、增重、血液學指標、血液生化指標和病理學等指標，評價蟬花菌質的安全性，以期為蟬花菌質作為飼料添加劑或飼料原料提供科學理論依據。

1 材料與方法

1.1 蟬花菌質 蟬花人工培育完成后，將蟬花子實體采收剩余的小麥培養基，在發酵過程中，小麥培養基大部被分解轉化，里面含有部分蟬花蟲草菌絲體，該樣品由浙江泛亞生物醫藥股份有限公司提供。

1.2 試驗動物 健康無特定病原體（SPF）級斯普拉格-杜勒（SD）大鼠100只，雌雄各半，試驗動物為4～5周齡，體重70～90 g，試驗用SD大鼠購自北京為通利華動物科技有限公司，合格證號：SCXK（京）2016-0011。

1.3 主要試劑和儀器 甲醛水溶液（含量37%～40%，天津市大茂化學試劑廠）；血液指示檢測試劑（上海科華生物工程股份有限公司）；稀釋液（法國優德實驗室公司）；清洗液（含酶，法國優德實驗室公司）；BS2202電子天平（北京賽多利斯儀器公司）；ELLIPSE全自動生化分析儀（法國優德公司）；Hema starⅡ血細胞分析儀 （法國YESBAERT）；切片機（美國Thermo）；顯微鏡（日本奧林巴斯公司）。

1.4 染毒劑量與分組 根據受試物急性毒性試驗結果，即半數致死量（LD50）大于5000 mg/kg體重，以及受試物加入飼料中最大量不能大于飼料量5%的限定，試驗設50000 mg/kg飼料（高）、10000 mg/kg飼料（中）、2000 mg/kg飼料（低）三個劑量組，另設一個陰性對照組。每組20只SD大鼠（雌雄各半），雌雄大鼠的體重差異控制在平均體重的20%以內。

1.5 受試物的配制 將受試物加入到各劑量鼠維持飼料中，在飼料混合器中攪拌均勻后制成顆粒飼料，試驗大鼠自由采食含有各劑量受試物的飼料，陰性對照組飼料中不添加受試物。

1.6 觀察指標

1.6.1 一般觀察 每日察看一次試驗動物的健康狀況，詳細記錄大鼠行為、眼口鼻是否有分泌物、糞便是否成形、是否腹瀉或便秘及糞便顏色、毛發是否黯淡無光、豎毛，仔細檢查各劑量組大鼠是否出現中毒癥狀及出現癥狀的時間、表現。假如發現死亡或瀕死大鼠，需要立即進行相應檢查，并對大鼠異常情況和死亡時間進行記錄，對死亡動物及時剖檢并取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸等組織做病理切片。所有試驗動物每5 d稱量一次體重和采食量，飲水每天計量一次（Liu等，2020）。

1.6.2 血常規檢查 在試驗結束時（第90天），各試驗組分別取5只雄性和5只雌性大鼠的血液，進行血紅蛋白（Hg）、紅細胞數（RBC）、白細胞數（WBC）、血小板數（PLT）、紅細胞壓積（HCT）、嗜酸性（EOS）、嗜堿性（BAS）、單核細胞（MO）、淋巴細胞（LY）等血液學指標檢測（董飛飛，2017；張淑慧，2015）。

1.6.3 血清生化檢查 在血常規檢查的同時對血清白蛋白（Alb）、谷丙轉氨酶（ALT）、谷草轉氨酶（AST）、尿素氮（BUN）、總膽固醇（TCH）、肌酐（Cr）、血糖（Glu）、總蛋白（TP）和甘油三酯（TG）等血液生化指標進行檢測（Rasmus等，2022）。

1.7 病理檢查

1.7.1 大體剖檢 在試驗結束時（第90天），各試驗組分別處死5只雄性和5只雌性大鼠，進行大體剖檢，如觀察到可疑病變組織，應及時固定保存并進行組織學檢查。大體剖檢的同時，需稱取體重及重要臟器重量，并計算心肝、腎、脾、肺、胃腸、睪丸及卵巢等臟器的臟器系數（Smitn等，2022）。

1.7.2 組織病理學檢查 在試驗結束時（第90天），各試驗組分別處死5只雄性和5只雌性大鼠，取心、肝、脾、肺、腎、十二指腸用10%中性福爾馬林溶液浸泡固定。對高劑量組和對照組試驗鼠的心、肝、脾、肺、腎、十二指腸等主要臟器制作常規病理石蠟切片，HE染色進行組織病理學檢查，如發現病變則需對較低劑量組試驗鼠的相應組織器官進行組織病理學檢查（宋翼升等，2017）。

1.8 統計分析 以t檢驗分析比較受試物各劑量組與陰性對照組之間的采食量、飲水量、日增重、血液學指標、血液生化指標及臟器系數等指標的差異顯著性，如有動物某臟器發生病變、腫瘤或動物發生死亡現象，則病變率、腫瘤發生率、死亡率等計數資料采用X2檢驗分析其差異顯著性。如分析結果為P值小于0.05，則判定其具有顯著性差異。

2 結果

2.1 一般觀察 在試驗期限（90 d）內，受試物高、中、低三個劑量組動物和陰性對照組動物均未見行為異常，并且其毛色順滑，眼口鼻無分泌物，糞便形態正常（淺灰色）。

2.2 采食量 由圖1可知，隨著喂養時間增加各試驗組采食量呈現增加趨勢，喂養至50 d時采食量趨于穩定，受試物高、中、低三個劑量組平均日采食量分別較對照組提高了0.31%、0.89%、0.19%（P＞0.05），表明蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內經自由采食連續給予大鼠90 d，對受試動物的采食量無顯著影響。

圖1 蟬花菌質對大鼠采食量的影響

2.3 飲水量 由圖2可知，受試物高、中、低三個劑量組平均日飲水量分別較對照組提高了2.91%、2.48%、1.06%（P＞0.05），表明蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內經自由飲水連續給予大鼠90 d，對受試動物的飲水量無顯著影響。

圖2 蟬花菌質對大鼠飲水量的影響

2.4 日增重 由圖3可知，受試物高、低兩個劑量組平均日增重分別較對照組提高了0.53%、0.26%（P＞0.05），受試動物中劑量組平均日增重較對照組降低了0.47%（P＞0.05），表明蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量對受試動物的增重無顯著影響。

圖3 蟬花菌質對大鼠平均增重的影響

2.5 血常規 從表1可以看出，受試物高劑量組、中劑量組、低劑量組動物在試驗期間的血液學指標與陰性對照組的血液學指標無顯著性差異（P＞0.05），表明蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內經自由采食給予大鼠90 d，對受試動物的血液學指標無顯著影響。

表1 喂養90 d時蟬花菌質對大鼠血液學指標的影響

2.6 血液生化指標 從表2可以看出，受試物高劑量組、中劑量組、低劑量組動物在試驗期間的血液生化指標與陰性對照組的血液生化指標無顯著性差異（P＞0.05），表明蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內經自由采食給予大鼠90 d，對受試動物的血液生化指標無顯著影響。

表2 喂養90 d時蟬花菌質對大鼠血液生化指標的影響

2.7 臟器系數 從表3可以看出，受試物高劑量組、中劑量組、低劑量組三個劑量組動物在試驗期間的臟器系數均與陰性對照組無顯著性差異（P＞0.05），表明經自由采食給予大鼠蟬花菌質對動物的心、肝、腎、脾、肺、胃腸、睪丸及卵巢等主要器官的臟器系數無顯著影響。

表3 喂養90 d時蟬花菌質對大鼠臟器系數的影響

2.8 病理檢查

2.8.1 大體剖檢 在試驗期限（90 d）內，受試動物未見發病和死亡現象，受試物高、中、低三個劑量組動物和陰性對照組動物的大體剖解均未見異常。

2.8.2 病變檢查 從圖4可以看出，受試物高劑量組動物和陰性對照組動物的上述臟器的組織切片均未見異常，表明在2000～50000 mg/kg飼料劑量內經自由采食給予大鼠蟬花菌質對受試動物的心、肝、脾、腎、十二指腸等主要臟器無不良影響。

圖4 主要臟器組織切片圖

3 討論

本研究通過大鼠90 d喂養試驗來開展蟬花菌質的安全性評價工作，蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內連續染毒90 d對SD大鼠的食欲、飲水、增重、血液學指標、血液生化指標和病理學指標均無顯著影響，在2000～50000 mg/kg飼料劑量內經自由采食給予大鼠蟬花菌質對受試動物的心、肝、脾、腎、十二指腸等主要臟器無不良影響。

蟬花作為一種古老的蟲草具有一千多年的入藥歷史（李增智等，2020），蟬花子實體（人工培植）已于2021年國家衛健委批準為新食品原料，其安全性已經得到長期驗證和認可，人工培養蟬花子實體的副產物蟬花菌質同樣蘊含豐富的營養價值，可作為免疫增強類飼料添加劑或飼料原料應用于畜禽疾病的預防中，對我國實施的生態養殖和健康養殖具有非常重要的意義（紀偉等，2021；李洋等，2019）。蟬花菌質所使用的菌株是經過嚴格的研究和篩選所得，其可以通過微生物發酵方法進行生產，不僅產量和營養價值高，且質量易控。通過蟬花菌質在飼料應用中的安全性研究，為今后蟬花菌質在飼料中應用提供科學理論依據（昆都孜斯坎達爾等，2019）。

4 結論

本研究結果表明，蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內連續染毒90 d，受試大鼠高、中、低三個劑量組平均日采食量、平均日飲水量、平均日增重較對照組均有一定提高，但以上均無顯著性差異；受試大鼠的血液學指標、血液生化指標和病理學指標與陰性對照組相比也均無顯著性差異；在試驗中期和試驗結束時對高劑量組及陰性對照組試驗鼠的心、肝、脾、腎、十二指腸等主要臟器的組織切片觀察，受試物高劑量組動物和陰性對照組動物的上述臟器的組織切片均未見異常。因此，本試驗（90 d喂養試驗）結果顯示蟬花菌質在2000～50000 mg/kg飼料劑量內無亞慢性毒性。