適宜肉鴨全價料發(fā)酵的益生菌體外篩選

亓秀曄，謝全喜，劉乃芝，郭楊麗，徐海燕

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動物微生態(tài)制劑重點實驗室，山東泰安 271000）

近年來，利用微生物發(fā)酵技術(shù)開發(fā)新型飼料資源越來越受到人們的重視。微生物發(fā)酵飼料是利用有益微生物對飼料發(fā)酵，增加易于消化與吸收小分子營養(yǎng)物質(zhì)含量，減少其中抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，提高飼料的消化利用率（胡文平等，2022；Xu等，2019；Missotten等，2016；Missotten等，2010）。同時，飼料經(jīng)過發(fā)酵，其中含有更多的活性益生菌菌體、有益代謝產(chǎn)物、有機酸和可溶性多肽，含有更多的乳酸及多種揮發(fā)性脂肪酸，此類物質(zhì)能夠抑制飼料中霉菌的生長，對于延長飼料保存起到積極作用 （胡文平等，2022；Missotten等，2016；Missotten等，2010）。禁抗時代的到來，微生物發(fā)酵飼料為綠色無抗飼料開辟了道路，其充分利用益生菌發(fā)酵的優(yōu)勢，能夠提高動物免疫力，改善動物抗病能力，提高飼喂動物的生長性能，在全面禁抗的大形勢下發(fā)揮替代抗生素的重要作用（王佰濤等，2022）。本文旨在研究適宜肉鴨全價料發(fā)酵的乳酸桿菌和酵母菌，并對篩選得到的單株菌兩兩配對進行混菌發(fā)酵，從影響體外固態(tài)發(fā)酵過程中的幾個主要營養(yǎng)指標(biāo)，包括活菌數(shù)、pH、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白、總酸含量等比較，為提升肉鴨全價料營養(yǎng)價值提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料 肉鴨全價料：由山東寶來利來生物工程有限公司提供。乳酸桿菌（Lacticacidbacteria）：BLCC2-0111、BLCC2-0112、BLCC2-0015、BLCC2-0092、BLCC2-0001、BLCC2-0114；酵母菌（Yeast）：BLCC4-0016、BLCC4-0018、BLCC4-0021、BLCC4-0048、BLCC4-0050、BLCC4-0327。所有菌株均由山東寶來利來生物工程股份有限公司研究院保存。

乳酸桿菌發(fā)酵用MRS培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、牛肉膏8 g/L、酵母膏4 g/L、硫酸鎂0.5 g/L、硫酸錳0.3 g/L、檸檬酸銨2 g/L、乙酸鈉5 g/L、吐溫-80 1 mL/L，pH 6.0，121℃滅菌20 min。計數(shù)用培養(yǎng)基為乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（LBS）。

酵母菌發(fā)酵用培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母膏0.5 g/L、磷酸二氫鉀2.0 g/L、pH自然，121℃滅菌20 min。計數(shù)用培養(yǎng)基為孟加拉紅培養(yǎng)基。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳酸桿菌和酵母菌發(fā)酵液的制備 將4℃保存條件下的乳酸桿菌斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h備用；將4℃條件下保存的酵母斜面活化，轉(zhuǎn)接到裝有50 mL酵母培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床振蕩培養(yǎng)16 h備用。

1.2.2 乳酸桿菌的篩選 稱取一定量的基料按料水比1.0∶0.4（g∶mL）配制好，裝袋（100 g/袋），每個樣品設(shè)3個平行，分別按照2%接種量接入培養(yǎng)好的乳酸桿菌發(fā)酵液，以不接種任何菌株的空白料為對照，壓實后于37℃培養(yǎng)箱進行生料厭氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 h和72 h取樣，測定pH和活菌數(shù)。

1.2.3 酵母菌的篩選 稱取一定量的基料于500 mL三角瓶中，料水比為1.0∶0.4（g∶mL），裝量50 g/瓶，按2%接種量分別接入培養(yǎng)好的酵母菌種子液，每個樣品設(shè)3個平行，以不接種任何菌株的空白料為對照，均置于30℃培養(yǎng)箱進行需氧發(fā)酵，分別于發(fā)酵24、48 h和72 h取樣，測定活菌數(shù)和粗蛋白質(zhì)含量。

1.2.4 乳酸桿菌和酵母菌混菌發(fā)酵 將上述篩選得到的乳酸桿菌和酵母菌進行混菌發(fā)酵，發(fā)酵方式為厭氧發(fā)酵，料水比為1.0∶0.4（g∶mL），裝袋（100 g/袋），每個樣品設(shè)3個平行，接種量2%，乳酸桿菌：酵母菌（3：2），以不接種任何菌株的空白料為對照，30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，分別于發(fā)酵24、48、72 h取樣，測定pH、活菌數(shù)、粗蛋白質(zhì)和總酸含量。

1.3 檢測方法 pH測定：取10 g樣品加入90 mL滅菌后的生理鹽水中，攪拌均勻后直接測定。

乳酸桿菌和酵母菌活菌數(shù)的測定：準(zhǔn)確稱取發(fā)酵飼料10.0 g，用生理鹽水10倍遞增稀釋，取適當(dāng)稀釋度的樣品分別至LBS培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基中，分別于37℃和30℃培養(yǎng)48 h，根據(jù)菌落數(shù)計算樣品中乳桿菌和酵母菌數(shù)量，結(jié)果用CFU/g表示。

總酸含量的測定：采用酸堿滴定法測定樣品中總酸含量。參照國標(biāo)GB/T12456—2008《食品中總酸的測定》。

粗蛋白質(zhì)含量的測定：參照GB/T6432—1994《飼料中粗蛋白質(zhì)測定方法》對蛋白質(zhì)含量進行測定。

酸溶蛋白含量的測定：參照QB/T2653—2004《大豆肽粉》中酸溶蛋白質(zhì)含量的測定，準(zhǔn)確稱取樣品2.00 g，加入15%三氯乙酸溶液25 mL，混合均勻，靜置30 min。將溶液定量轉(zhuǎn)移，在4000 r/min條件下離心10 min后，取全部上清液，以下按照上述粗蛋白質(zhì)的測定方法。結(jié)果為占粗蛋白質(zhì)的百分含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析 試驗數(shù)據(jù)用Excel軟件進行初步處理后，采用SPSS 13.0進行統(tǒng)計分析，采用One-wayANOVA進行方差分析，LSD法進行組間多重比較，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜肉鴨全價料發(fā)酵的乳酸桿菌篩選 由表1可以看出，pH方面：隨著發(fā)酵時間延長各菌株pH均出現(xiàn)降低的趨勢，BLCC2-0111在發(fā)酵至24 h時pH已降至較低水平，至72 h時pH降至最低，為4.03，其次為BLCC2-0112，72 h時pH為4.13，均顯著低于其他組（P＜0.05），前兩者差異不顯著。活菌數(shù)方面：以BLCC2-0111和BLCC2-0111發(fā)酵后活菌數(shù)較高，24 h和48 h時，除對照組和BLCC2-01114外，前兩者顯著高于其他組（P＜0.05），72 h時，前兩者顯著高于其他菌株（P＜0.05）。綜合來看，適宜肉鴨全價料發(fā)酵的乳酸桿菌為BLCC2-0111和BLCC2-0112。

表1 6株乳酸桿菌發(fā)酵肉鴨全價料對pH和活菌數(shù)的影響

2.2 適宜肉鴨全價料發(fā)酵的酵母菌篩選 由表2可以看出，BLCC4-0050在發(fā)酵至24 h時，活菌數(shù)顯著高于其他組1個數(shù)量級（P＜0.05），72 h時，除BLCC4-0021外，顯著高于其他組（P＜0.05）；BLCC4-0021在24 h時稍低于BLCC4-0015，48 h和72 h時高于BLCC4-0050，兩者差異不顯著。BLCC4-0050和BLCC4-0021的粗蛋白質(zhì)含量在各時間段內(nèi)均顯著高于其他組（P＜0.05）。綜合來看，適宜肉鴨全價料發(fā)酵的酵母菌菌株為BLCC4-0050和BLCC4-0021。

表2 6株酵母菌發(fā)酵肉鴨全價料對粗蛋白質(zhì)和活菌數(shù)的影響

2.3 適宜肉鴨全價料發(fā)酵的混菌菌株篩選 由表3可以看出，pH方面：乳酸桿菌單菌發(fā)酵后的發(fā)酵樣pH降低幅度較大，其pH顯著低于對照和酵母單獨發(fā)酵樣（P＜0.05），略低于混菌發(fā)酵樣；酵母菌單菌發(fā)酵對pH影響較小，而酵母菌和乳酸桿菌混菌發(fā)酵時，pH降低較明顯，尤其到72 h時，其pH水平已經(jīng)與乳酸桿菌單菌發(fā)酵相當(dāng)。活菌數(shù)方面：無論是乳酸桿菌單菌發(fā)酵還是混菌發(fā)酵，其隨著時間延長乳酸桿菌活菌數(shù)遞增且一直在較高水平；酵母菌單菌發(fā)酵優(yōu)于混菌發(fā)酵（P＜0.05）；混菌發(fā)酵時乳酸桿菌活菌數(shù)和酵母菌活菌數(shù)均低于單菌發(fā)酵。整體來看，以BLCC2-0111+BLCC4-0021混菌發(fā)酵效果較優(yōu)。

表3 混菌發(fā)酵肉鴨全價料對pH和活菌數(shù)的影響

由表4可以看出，粗蛋白質(zhì)方面：無論單菌發(fā)酵還是混菌發(fā)酵，發(fā)酵組顯著高于對照組（P＜0.05），但發(fā)酵組間差異不顯著。酸溶蛋白方面：24 h時，發(fā)酵組顯著高于對照組（P＜0.05），但發(fā)酵組間差異不顯著；48 h和72 h時，除BLCC2-0112+BLCC4-0021組外，以酵母菌單菌發(fā)酵高于混菌發(fā)酵高于乳酸桿菌單菌發(fā)酵，尤其是72 h時，酵母菌單菌發(fā)酵和混菌發(fā)酵顯著高于乳酸桿菌單菌發(fā)酵（P＜0.05）。總酸方面：與pH變化規(guī)律基本一致，乳酸桿菌大于混菌大于酵母菌單菌。整體來看，以BLCC2-0111+BLCC4-0021混菌發(fā)酵效果較優(yōu)。

表4 混菌發(fā)酵對飼料品質(zhì)的影響

3 結(jié)論與討論

飼料經(jīng)發(fā)酵后其有益菌分泌的多種酶作用于抗?fàn)I養(yǎng)因子，對抗?fàn)I養(yǎng)因子降解或代謝，消除其抗?fàn)I養(yǎng)作用，進而提高營養(yǎng)成分含量。研究發(fā)現(xiàn)，菜籽粕經(jīng)微生物發(fā)酵后降低了抗?fàn)I養(yǎng)因子水平，同時多菌株發(fā)酵對飼料品質(zhì)改善的效果優(yōu)于單菌株發(fā)酵，飼料經(jīng)發(fā)酵后營養(yǎng)成分也會發(fā)生變化，大分子物質(zhì)被降解，同時一些多肽和游離氨基酸的產(chǎn)量也不斷增加（陳娟等，2010）。發(fā)酵豆粕的粗蛋白質(zhì)質(zhì)和酸溶蛋白含量較豆粕均升高（李瑩等，2019）。棉籽粕經(jīng)枯草芽孢桿菌和釀酒酵母發(fā)酵后可以降低游離棉酚并提高酸溶蛋白含量（李園成等，2020）。

飼料發(fā)酵利用的益生菌，如枯草芽孢桿菌和酵母菌好氧菌可消耗氧氣并創(chuàng)造厭氧環(huán)境有利于乳酸菌等厭氧菌的繁殖，乳酸菌由于可產(chǎn)生大量乳酸而降低pH使飼料產(chǎn)生酸香味，對飼料適口性有較大改善，使動物采食量增加（Domingos等，2021）。本試驗中，乳酸菌和酵母菌混菌發(fā)酵，厭氧條件下，隨著發(fā)酵時間延長，發(fā)酵料pH下降顯著，說明乳酸菌快速繁殖；然而與乳酸菌單菌相比，混菌發(fā)酵乳酸菌發(fā)酵減弱，說明酵母菌的繁殖產(chǎn)生酒精等物質(zhì)抑制了乳酸菌的生長；同時，混菌發(fā)酵料總酸顯著升高，一定程度上也抑制了酵母菌的繁殖（與單菌相比）；但是，混菌發(fā)酵酸溶蛋白含量顯著提升，飼料營養(yǎng)價值提升。

本試驗利用乳酸桿菌和酵母菌體外發(fā)酵肉鴨全價料，通過發(fā)酵前后活菌數(shù)、pH、粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白、總酸含量等指標(biāo)的比較，篩選出適宜肉鴨全價料發(fā)酵的乳酸桿菌和酵母菌。結(jié)果為：（1）適宜肉鴨全價料發(fā)酵的最適乳酸桿菌為BLCC2-0111和BLCC2-0112，發(fā)酵至72 h時，pH達到最低，分別為4.03和4.13，活菌數(shù)最高，分別為33.61×108CFU/g和25.68×108CFU/g。（2）適宜肉鴨全價料發(fā)酵的最適酵母菌為BLCC4-0050和BLCC4-0021，發(fā)酵至72 h時，粗蛋白質(zhì)含量最高，分別為17.78%和17.77%，活菌數(shù)最高，分別為30.23×108CFU/g和35.54×108CFU/g。（3）適宜肉鴨全價料發(fā)酵的最適混菌組合為BLCC2-0111+BLCC4-0021，發(fā)酵至72 h時，pH降至最低4.12，乳酸桿菌活菌數(shù)38.00×108CFU/g，總酸含量20.61 mg/g，酸溶蛋白含量13.49%，混菌發(fā)酵的飼料營養(yǎng)價值顯著優(yōu)于單菌發(fā)酵。